Prof. dr. Hans Clevers is voormalig directeur van het Hubrecht Instituut voor Ontwikkelingsbiologie en Stamcelonderzoek van de KNAW, hoogleraar Moleculaire Genetica in het UMC Utrecht en sinds vorig jaar wetenschappelijk directeur van het Prinses Máxima Centrum. Hij schetste een kleurrijk beeld van zijn werk aan stamcellen en organoïden.
Clevers prefereert een simpele definitie van een stamcel: een cel die in actie kan komen als er weefsel verdwijnt en via celdeling die cellen weer vervangt. “Er zijn waarschijnlijk honderden verschillende soorten stamcellen in ons lichaam en het oorspronkelijke concept van de zeldzame, onvindbare, nauwelijks delende stamcel blijkt in veel gevallen niet op te gaan. Er is vaak sprake van een enorme plasticiteit: volledig gedifferentieerde cellen kunnen weer een stamcelfunctie krijgen en naargelang de behoefte van het weefsel binnen enkele dagen verschillende celtypen genereren.”
Het Hubrecht Laboratorium is geïnteresseerd in darmepitheel, dat bij zowel muis als mens verreweg het actiefste stamcelsysteem van het lichaam herbergt. Deze stamcellen worden aangetroffen in de crypten van Lieberkühn en genereren uiteindelijk zes verschillende celtypen. Deze cellen migreren tijdens en na hun uitrijping in twee dagen naar de top van de villi, waar ze verdwijnen via apoptose. Elk crypte-villussysteem (de muis heeft er ongeveer een miljoen, de mens een miljard) is een zelfstandige eenheid en het hele darmepitheel wordt elke vier á vijf dagen volledig vernieuwd. “Dat impliceert dat dit weefsel bij uitstek geschikt is voor experimenten.”
Unieke marker
In 1991 kloneerde de groep van Clevers de T-celspecifieke transcriptiefactor (TCF1). Vervolgens ontdekten ze dat leden van de TCF-familie bij verschillende dierlijke organismen effectoren zijn van de Wnt-signaleringsroute; de interesse verschoof naar de rol van Wnt-signalering in cellulaire zelfvernieuwing en kanker van het darmepitheel.
“Eigenlijk dacht men dat de rol van Wnt-factoren na de embryonale ontwikkeling zo’n beetje was uitgespeeld, maar Wnt-eiwitten bleken in feite de belangrijkste groeifactoren voor darmstamcellen – zo toonden we bij muizen aan dat gendisruptie van TCF4 de crypten van de dunne darm elimineert. Tegelijkertijd ontdekten we dat een mutatie in het tumorsuppressoreiwit APC, dat onderdeel is van de Wnt-signaleringsroute, familiaire adenomateuze polyposis veroorzaakt en vrijwel alle sporadische darmkankers. Zodra microarrays beschikbaar kwamen, zijn we op zoek gegaan naar de moleculaire overeenkomsten tussen regulatie van darmstamcellen en kanker en dat culmineerde in het identificeren van het eiwit Lgr5 als specifieke marker voor volwassen epitheliale stamcellen.”
Door bij muizen een gen voor groen fluorescerend proteïne (GFP) in te brengen in het lgr5-locus kon Clevers groep aantonen dat deze kleine, smalle stamcellen constant en op een symmetrische wijze delen. Ook slaagden de onderzoekers erin om individuele stamcellen (en hun nakomelingen) een eigen fluorescerende kleur te geven (‘confettidarm’). “We zien dat zo’n crypte zich langzaam maar zeker vult met stamcelnazaten, maar uiteindelijk krijgt iedere crypte slechts één kleur: er is dus binnen zo’n crypte geduchte competitie tussen de stamcellen.”
Minidarmen
Het onderzoek van Clevers leverde een aantal onverwachte bevindingen op. “De vrees dat het kweken van stamcellen buiten het lichaam selecteert voor oncogene varianten bleek ongegrond. Het is opvallend dat deze cellen voortdurend blijven delen, zonder al te veel DNA-schade op te lopen. De beroemde Hayflick-limiet stelt dat cellen tussen 40 en 60 keer kunnen delen, waarna de chromosoomuiteinden, de telomeren, te kort zijn geworden en de cellen stoppen met delen, in senescentie gaan en uitrijpen. Echter, voor deze darmstamcellen gaat dat niet op – we hebben ze nu al bijna vijf jaar in kweek en wekelijks groeien ze het tienvoudige in volume en blijven genetisch stabiel.”
Door de GFP-marker bleek het relatief eenvoudig de stamcellen uit darmcrypten te isoleren en binnen Clevers lab slaagde een postdoc uit Tokyo, dr. Toshiro Sato, erin om de darmniche na te bootsen in petrischaaltjes.1 Clevers: ‘’Een gelatineuze matrix (matrigel) en een cocktail van slechts drie groeifactoren volstaan om stamcellen aan het delen te krijgen: R-spondine, epitheliale groeifactor (EGF) en noggine. We breken de ontstane één á twee millimeter grote organoïden of ‘minidarmen’ elke week in kleine stukjes. Ze bevatten multipele crypten met stamcellen, de stamcel bewakende Panethcellen, sneldelende stamceldochtercellen, uitgerijpte darmslijmvliescellen en dode cellen. Het is dus totaal zelf organiserend: elke stamcel bouwt een miniversie van de darm.
Sato heeft van een muis met in alle cellen een lichtgevend eiwit één darmstamcel vermeerderd tot een miljard en deze cellen naar Tokyo gestuurd. Daar had men muizen voorbehandeld met DSS, een stofje dat colitis veroorzaakt. De minidarmen zijn vervolgens geïntroduceerd in het colonlumen van deze muizen: na enkele uren vonden die de laesies en vormden een soort levende pleisters. Zo zijn zo’n veertig muizen succesvol behandeld. Het colonweefsel is al 2,5 jaar functioneel en we zien nooit adenomen verschijnen. Tevens hebben we op gezette tijden de cellen genetisch onderzocht: we zien eigenlijk alleen puntmutaties, met vergelijkbare frequentie als wordt waargenomen in kiemcellen. Ook de telomeren blijven op lengte.”
Waarschijnlijk zijn deze stamcellen veilig te gebruiken voor regeneratieve geneeskunde en sowieso bruikbaar om ziekten vanuit de patiënt direct te recapituleren in het laboratorium en er mechanistische studies mee te doen. Bijvoorbeeld voorspellen wat een goed geneesmiddel zou kunnen zijn voor een individuele patiënt. Inmiddels is de groep van Clevers erin geslaagd Lgr5-positieve stamcellen uit biopten van allerlei menselijke weefsels op te kweken tot genetisch en fenotypisch extreem stabiele mini-organen.
Levende biobank
Veel tumortypen zijn volgens Clevers in vitro na te bootsen voor het testen van chemotherapeutica. “We hebben er nu zo’n honderd in onze ‘levende biobank’, en in 95% van de gevallen zijn hieruit tumororganoïden te kweken. Maar sommige tumortypen, zoals long- en prostaatkanker, zijn weerbarstig omdat ze meestal een mix zijn van kankerepitheel en stromacellen; de normale wildtypecellen overgroeien de kweek dan al snel en dat hebben we nog niet opgelost.”
In recente studies is high-throughputscreening van een omvangrijk panel kankercellijnen ingezet om patronen te ontdekken in gevoeligheid voor antikankermiddelen en die te correleren aan specifieke genetische veranderingen. Hieruit is gebleken dat die relaties allesbehalve eenvoudig zijn: medicijngevoeligheid kan zijn bepaald door complexe en voor iedere tumor unieke interacties tussen verschillende genetische veranderingen. Tumoren blijken te zijn samengesteld uit mengsels van op basis van darwinistische selectiemechanismen uitgeselecteerde subklonen en dit vormt de basis voor kenmerken als geneesmiddelresistentie en metastaserend vermogen. De polyklonale aard van biopten wordt vaak weerspiegeld in de corresponderende organoïden en die zouden dus een relevant model kunnen zijn voor therapeutische responsen, vergelijkbaar met xenografts van tumorbiopten bij immuundeficiënte muizen.
Clevers: “Ze zouden de leemte kunnen vullen tussen genetische analyse en klinische studies, complementair aan geneesmiddelentests op cellijnen en xenografts, en zo de weg openen naar een gepersonaliseerde behandeling.”2,3
Inmiddels heeft het Hubrecht Instituut samen met het Antoni van Leeuwenhoek in Amsterdam een haalbaarheidsonderzoek afgerond naar de voorspellende waarde van tumororganoïden uit biopten van patiënten met uitgezaaide darmkanker en op basis hiervan is onlangs onder leiding van prof. dr. Emile Voest de TUMOROID-studie van start gegaan.
Referenties
1. Sato T, et al. Nature 2009;459:262-5.
2. Van de Wetering M, et al. Cell 2015:161:933-45.
3 Weeber F, et al. Proc Acad Sci USA 2015;112:13308-11.
Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapsjournalist
Oncologie Up-to-date 2016 vol 7 nummer 2
DEEL DIT ARTIKEL:
