Onderzoekers van het UMC Utrecht ontwikkelden een nieuwe techniek waarmee fusiegenen in tumor-DNA snel gekarakteriseerd kunnen worden. Naar aanleiding van de publicatie van het desbetreffende onderzoek in Nature Communications schetst dr. Glen Monroe, medisch-genetisch onderzoeker en een van de auteurs van het artikel, hoe deze techniek in zijn werk gaat en wat de potentie ervan is.
Fusiegenen zijn combinaties van twee genen die normaliter los van elkaar op verschillende plaatsen op het genoom gelokaliseerd zijn. Door translocaties in het genoom kunnen nieuwe combinaties van genen ontstaan die andere biologische eigenschappen hebben dan de oorspronkelijke genen. Veel van de fusiegenen die tot nu toe bekend zijn, blijken te functioneren als oncogen. Een bekend voorbeeld van een oncogene genfusie, die al vroeg ontdekt is, is de BCR-ABL-fusie. Deze geldt als drijvende kracht achter chronische myeloïde leukemie (CML) en is het doelwit van verschillende tyrosinekinaseremmers die succesvol zijn gebleken bij de behandeling van CML. Inmiddels zijn veel meer oncogene genfusies bekend, zoals die van het NTRK-gen met uiteenlopende fusiepartners die als oncogenen bij uiteenlopende tumortypen zijn geïdentificeerd, en, naast BCR-ABL, verschillende fusiegenen bij leukemieën.
Glen Monroe en collega’s van het UMC Utrecht (UMCU) werken, samen met het Prinses Máxima Centrum voor kinderoncologie en Charité – Universitätsmedizin Berlin (Duitsland), aan genfusies die van belang zijn voor pediatrische maligniteiten. Ze ontwikkelden voor de identificatie daarvan een nieuwe techniek die ze de naam FUsion Detection from Gene Enrichment (FUDGE) meegaven. Het is een onderdeel van het promotieonderzoek van Christina Stangl, eerste auteur van het artikel in Nature Communications.1
Wat is FUDGE?
FUDGE is eigenlijk een combinatie van bestaande technieken uit de moleculaire biologie, overgoten met een eigen sausje van de UMCU-onderzoekers. Monroe legt uit hoe deze complexe techniek in elkaar steekt: “Een belangrijk onderdeel van onze technologie is CRISPR-Cas9, een soort schaar waarmee je dubbelstrengs-DNA op een vooraf bepaalde positie door kunt knippen. In dit geval de locatie van het gen waarvan we de fusiepartners willen identificeren. Om CRISPR-Cas9 op de juiste plek te krijgen, gebruiken we crRNA als gidsen. Dit zijn enkelstrengs-RNA-fragmenten gericht op slechts een van de DNA-strengen, de plus- of de min-streng. Deze crRNA’s die we zelf ontwerpen, zijn essentieel voor FUDGE, want ze leiden CRISPR-Cas9 naar de exacte positie van het doelwitgen op het DNA. Je moet dus vooraf wel een van de fusiepartners kennen om de bijbehorende fusiegenen te kunnen identificeren.”
Nanopore sequencing is de techniek waarmee Monroe en collega’s vervolgens real-time selectief en vanaf één kant de basenvolgorde van de lange DNA-fragmenten naast de knip bepalen. Dit resulteert in de sequencing van meer van deze moleculen; in deze studie werden de breekpunten in het genoom van de fusiegenen gedekt door gemiddeld 68 reads. “Dat is veel meer dan je normaliter zou verwachten en resulteert in 665-voudige verrijking van deze genoomgebieden”, weet Monroe.
Aan het eind van het proces vertaalt bio-informatica de signalen van de nanopore sequencing in de identiteit van de fusiepartner en de precieze positie waarop de beide genen met elkaar verbonden zijn, het genoombreekpunt.
Grootste winstpunt
Vooral de snelheid waarmee FUDGE fusiegenen kan identificeren steekt gunstig af bij die van andere technieken waarmee dat ook kan, zoals fluorescente in-situhybridisatie (FISH), RT-qPCR of next generation sequencing (NGS). Monroe: “Bijvoorbeeld, NGS is een krachtige techniek voor de opsporing van fusiepartners, maar het duurt daarmee veel langer tot je de uitslagen hebt dan met FUDGE. Met onze techniek kunnen we binnen 48 uur de fusiepartners van ons doelwitgen identificeren, mits we de benodigde crRNA’s klaar hebben staan. Met NGS kan dat wel enkele weken duren en de kosten van NGS zijn hoger. De FUDGE-techniek stelt ons ook in staat de fusiepartner en het genoombreekpunt nauwkeuriger te bepalen dan met normale sequencing en met minder reads om de breekpuntpositie te dekken.”
Behalve snelheid heeft FUDGE als voordeel dat er geen kennis vooraf nodig is over de mogelijke fusiepartners noch de locatie van het breekpunt om de techniek met succes te kunnen gebruiken. FUDGE levert niet alleen informatie over de identiteit van de fusiepartner(s) van een bepaald gen, het geeft ook de breekpuntlocaties aan.
Een beperking van FUDGE in vergelijking met NGS is dat FUDGE niet bruikbaar is bij formalinegefixeerde en paraffine-ingebedde weefselmonsters. Verse en vers ingevroren weefselmonsters zijn wel geschikt voor analyse met FUDGE. Er is in principe maar heel weinig tumor-DNA (ongeveer 10 nanogram) voor nodig, maar het werkt het beste met 1 microgram DNA.
Veelbelovende resultaten
Monroe benadrukt dat FUDGE op dit moment nog een experimentele techniek is die in het researchlaboratorium is ontwikkeld met behulp van tumorcellijnen waarvan bekend is dat ze fusiegenen hebben. De techniek moet nog verder doorontwikkeld worden om als diagnostische assay in de gereedschapskist van de patholoog opgenomen te kunnen worden. “Hiermee zullen nog wel enkele jaren gemoeid zijn. Gelukkig zijn onze eerste resultaten met de toepassing van FUDGE in de diagnostiek van pediatrische tumoren, in samenwerking met het Prinses Máxima Centrum, veelbelovend”, aldus Monroe.
In hun artikel beschrijven de onderzoekers resultaten met verschillende solide kindertumoren, waaronder ewing- en rhabdomyosarcoom, en hematologische kankers die veel voorkomen bij kinderen, zoals CML, burkittlymfoom en B-cel acute lymfatische leukemie (B-ALL). Ze vonden daarbij 22 unieke fusiegenen van verschillende samenstelling. Tot de geïdentificeerde fusiegenen behoorden, zoals verwacht bij deze maligniteiten, onder andere EWSR1-FL11 (ewingsarcoom), PAX3-FOXO1 (rhabdomyosarcoom), BCR-ABL1 (CML, B-ALL) en CRLF2-P2RY8 (B-ALL).
Toekomstige toepassingen
FUDGE is een gevoelige vorm van moleculaire diagnostiek waarbij precies in kaart gebracht wordt welke genfusies en andere typen herschikking van genen aanwezig zijn in tumormateriaal. Zo kan snel de juiste moleculaire diagnose gesteld worden en een passende individuele behandeling gestart worden. FUDGE is volgens Monroe een techniek waarmee monitoring van minimale restziekte (MRD) tijdens de behandeling in de nabije toekomst al mogelijk zal zijn. “Hierbij willen we FUDGE gebruiken om snel fusiegenen en genoombreekpunten te identificeren, zodat we snel PCR-primers kunnen ontwerpen om te volgen hoe de tumor zich ontwikkelt”, vertelt Monroe.
“Bij patiënten met leukemie kunnen we gemakkelijk tumor-DNA afnemen om FUDGE mee uit te voeren en zo snel doelwitten voor MRD-monitoring identificeren. Met PCR-assays voor deze MRD-doelwitten kunnen we dan zien of deze afnemen of toenemen in respons op behandeling en of er sprake is van resistentieontwikkeling.”
FUDGE kan op termijn ook nieuwe doelwitten voor het ontwerpen van antikankermiddelen opleveren. Het voorbeeld van TRK-remmers die recentelijk wereldwijd geregistreerd zijn voor uiteenlopende solide tumoren met een NTRK-genfusie, bewijst dat fusiegenen klinisch relevante doelwitten kunnen zijn. Voorlopig ligt de focus van de Utrechtse onderzoekers echter bij het verder valideren en optimaliseren van de FUDGE-technologie.
Referentie
1. Stangl C, et al. Nat Commun 2020;11:2861.
Dr. Marinus Lobbezoo, wetenschapsjournalist
DEEL DIT ARTIKEL:
