Met rasse schreden doet next generation sequencing zijn intrede in de pathologische diagnostiek. De techniek wordt sinds ruim een jaar routinematig gebruikt voor de identificatie van mutaties in een specifieke set genen. Detectie van translocaties behoort tot de andere mogelijkheden. Toepassing van next generation sequencing blijkt hersentumoren zelfs beter te kunnen classificeren dan de huidige histopathologische technieken. Dit onderwerp kreeg dan ook ruime aandacht tijdens de recente bijeenkomst van de werkgroep ‘Moleculaire diagnostiek in de pathologie’ in Utrecht.
“Het wordt steeds belangrijker om met behulp van moleculaire technieken te kunnen vaststellen welke patiënten in aanmerking komen voor een specifieke behandeling”, vertelde dr. ir. Wendy de Leng, klinisch moleculair bioloog in de pathologie (KMBP) in opleiding, UMC Utrecht. Nu next generation sequencing (NGS) steeds sneller en goedkoper kan, komt deze techniek binnen het bereik van de routinematige diagnostiek. De Leng valideerde het gebruik van NGS om meerdere genen gelijktijdig te kunnen sequencen.
Validatie
Voor de minimaal benodigde hoeveelheid DNA van 20 ng is ongeveer 1 cm2 weefsel van 5 µm dikte nodig. Zowel paraffine-ingebed (FFPE) als vers ingevroren weefsel zijn goed bruikbaar. Op basis van tests formuleerden De Leng en collega’s kwaliteitscriteria waar een betrouwbare single nucleotide variant (SNV) aan zou moeten voldoen. Vervolgens valideerden ze de NGS-techniek in 250 FFPE-weefsels. De concordantie tussen conventioneel sequencen en NGS was 98,5%. Een aantal SNV’s werd niet gedetecteerd met NGS of niet gezien door de software. In een enkel geval was NGS sensitiever. De Leng: “Het is belangrijk om de gegevens ook handmatig te bekijken, omdat de software iets kan missen.” De mutaties die de onderzoekers vonden met NGS komen overeen met de verwachtingen bij een specifiek tumortype.
Omdat whole genome sequencing nog niet haalbaar is, kozen de onderzoekers voor een ‘targeted approach’ waarbij ze een specifieke set genen analyseren. Tot het huidige 50-genenpanel behoren onder andere TP53, BRAF, RAS en EGFR om onder andere long- en darmtumoren te onderzoeken. Dit panel kan aan de hand van nieuwe kennis eenvoudig worden aangepast. De Leng en collega’s hebben al meer dan 900 monsters routinematig gesequencet met NGS sinds de start in oktober 2013. Een multidisciplinair team bespreekt de resultaten, zodat vijf dagen na binnenkomst van een monster een rapport beschikbaar is dat eindigt met een klinische interpretatie.
Translocaties
Een andere toepassing van NGS is de detectie van translocaties. De identificatie van specifieke translocaties is belangrijk voor onder andere de differentiaaldiagnose van weke-delentumoren en bij de therapiekeuze bij longkanker. Pathologielaboratoria gebruiken daarvoor in-situhybridisatie, immuunhistochemie en PCR. Dr. Bastiaan Tops, KMBP bij het Radboudumc te Nijmegen onderzocht of het mogelijke is NGS te gebruiken voor de detectie van translocaties.
Met behulp van een gerichte (targeted) PCR-methode die specifieke translocaties kan detecteren, is het mogelijke in een aantal cellijnen en FFPE-tumorweefsels met bekende ALK-translocaties de fusie met NGS te detecteren. Daarnaast bepaalde Tops de balans tussen de expressie van het 5’- en 3’-uiteinde van bijvoorbeeld het ALK-gen op basis van NGS-gegevens. Een onbalans is een indicatie voor de aanwezigheid van een translocatie. De concordantie met andere methodes was meer dan 98%. De techniek was reproduceerbaar tussen verschillende laboratoria en had een detectielimiet van 5%. Toch verwacht Tops niet dat dit de methode van de toekomst is. “Ik denk dat er betere methodes zijn, zoals anchored PCR based enrichment, maar het is wel een mooi voorbeeld van hoe het in theorie heel goed zou kunnen werken”, besloot hij zijn presentatie.
Therapiekeuze
In de neuro-oncologie kent de toepassing van moleculaire tests en NGS een duidelijk klinisch belang. “Het probleem van de histopathologie van hersentumoren is de enorme interobservervariatie. Nog vervelender is het dat het ons niet helpt bij het kiezen van de behandeling”, aldus prof. dr. Martin van den Bent, neuro-oncoloog bij het Erasmus MC Kanker Instituut. Zo trokken internationale studies totaal andere conclusies over de prognose van patiënten met een gemengd oligo-astrocytoom. Later bleek de IDH-mutatiestatus die verschillen te kunnen verklaren.
De toepassing van moleculaire markers kan helpen bij de therapiekeuze. Als voorbeeld noemde Van den Bent methylering van de promoter van MGMT, een DNA-reparatiegen. Patiënten met een glioblastoom waarbij de MGMT-promoter gemethyleerd is, reageerden duidelijk beter op behandeling met het alkylerende middel temozolomide dan patiënten waarbij dat niet het geval is, terwijl het voor de behandeling met radiotherapie niet uitmaakte. MGMT-promotermethylering kan dus helpen bij de keuze voor behandeling met temozolomide. “Het grote probleem blijft nog dat er verschillende assays bestaan, die nog niet allemaal geijkt zijn”, merkte Van den Bent op.
Classificatie
“Het gaat er nu steeds meer naar toe dat we moleculaire veranderingen gebruiken als criterium voor het stellen van een bepaalde diagnose”, aldus Van den Bent. Een gecombineerd verlies van de chromosomen 1p en 19q komt voor bij meer dan driekwart van de patiënten met een oligodendroglioom en is een marker voor chemotherapiegevoeligheid die geassocieerd wordt met een betere overleving. Ook andere markers wijzen op een voordeel voor adjuvante chemotherapie bij graad II- en III-gliomen, zoals mutatie in IDH1/2. Mutaties in TP53 en ATRX komen veel voor bij astrocytomen, terwijl glioblastomen gekenmerkt worden door verlies van chromosoom 10q, mutaties in TERT en PTEN, en amplificatie van EGFR.
Een combinatie van deze factoren lijkt een veel sterkere prognostische waarde te hebben dan de diagnose die de patholoog stelt. Van den Bent kan op basis van moleculaire karakteristieken een drietal subtypen onderscheiden die te vergelijken zijn met astrocytomen, oligodendrogliomen en glioblastomen, met een heel verschillende overlevingsduur van respectievelijk 5-10 jaar, 10-15 jaar en 12-18 maanden. Bepaalde combinaties van factoren, of juist de afwezigheid daarvan, kunnen helpen bij het stellen van een diagnose of iets zeggen over de prognose. Sommige mutaties komen bijvoorbeeld nooit gelijktijdig voor, zoals ATRX-mutaties en 1p/19q-verlies, wat gebruikt kan worden om betere diagnoses te stellen. Patiënten met een TERT-mutatie in combinatie met 1p/19q-verlies hebben een veel betere prognose dan patiënten met alleen een TERT-mutatie.
Van den Bent en collega’s ontwierpen een genenpanel voor NGS en testen deze op monsters van hersentumoren uit het archief. Het model voor moleculaire classificatie dat ze op basis daarvan bouwden, bleek meer prognostische betekenis te hebben dan de histopathologische classificatie. “Naar mijn idee zijn we op dit moment bezig met een transitie van een histopathologische diagnose naar een op moleculaire karakteristieken gebaseerde diagnose”, meent Van den Bent. “De volgende stap is het toewerken naar targeted treatments.”
Dr. A. Danen, wetenschapsjournalist
Oncologie Up-to-date 2015 vol 6 nummer 2
DEEL DIT ARTIKEL:
