Door de aanhoudende komst van nieuwe doelgerichte therapieën bij kanker, is ook de moleculaire diagnostiek continu onderhevig aan veranderingen. Zo is screening op RET- en NTRK-fusies een belangrijk onderdeel geworden van de diagnostiek bij diverse vormen van kanker. De keuze van de juiste moleculaire techniek is essentieel om patiënten met genetische afwijkingen zo efficiënt mogelijk te identificeren en te selecteren voor de optimale therapie. Tijdens de 15e (virtuele) bijeenkomst Moleculaire diagnostiek in de pathologie presenteerden de klinisch moleculair biologen in de pathologie dr. Erik Jan Dubbink (Erasmus MC te Rotterdam) en dr. Léon van Kempen (UMC Groningen) de recentste inzichten in de toepasbaarheid van verschillende moleculaire technieken voor de detectie van RET- en NTRK-fusies.
In de laatste jaren zijn zowel RET- als NTRK-fusies geïdentificeerd als belangrijke oncogene drivers van verschillende soorten tumoren. Dit leidde vervolgens tot de ontwikkeling en registratie van selectieve RET- en TRK-remmers. Dankzij deze middelen hebben patiënten met een genetische afwijking in RET of NTRK een behandeling beschikbaar die zowel effectief als goed te verdragen is. Zo is de RET-remmer selpercatinib geassocieerd met een langdurige respons en intracraniële activiteit bij onder andere eerder behandelde patiënten met RET-fusie-positief, gevorderd niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) en RET-gemuteerd medullair schildkliercarcinoom (MTC).1,2 Daarnaast zijn de TRK-remmers larotrectinib en entrectinib geassocieerd met een robuuste antitumoractiviteit bij patiënten met NTRK-fusie-positieve tumoren.3,4
Om zoveel mogelijk patiënten te identificeren die mogelijk baat hebben van deze doelgerichte therapieën, is adequate diagnostiek van groot belang. Genetische afwijkingen in RET en NTRK kunnen worden gedetecteerd met verschillende technieken, zoals immunohistochemie (IHC), fluorescente in-situhybridisatie (FISH), reverse-transcriptase-polymerasekettingreactie (RT-PCR) en next generation sequencing (NGS) op DNA of RNA. Hoewel elke techniek verschillende voor- en nadelen heeft, is de sensitiviteit en specificiteit van een techniek grotendeels afhankelijk van het type tumor en genetische afwijking.
RET-fusies
RET-fusies komen voor bij 10-20% van de patiënten met papillair schildkliercarcinoom (PTC) en bij 1-2% van de patiënten met NSCLC.5 De meest voorkomende RET-fusies bij PTC zijn CCDC6-RET (59%) en NCOA4-RET (36%), terwijl KIF5B-RET (84%) en CCDC6-RET (15%) het vaakst worden gezien bij NSCLC.5 Daarnaast komen RET-fusies sporadisch voor bij patiënten met colorectaal carcinoom, melanoom, chronische myeloïde leukemie en mammacarcinoom.
Volgens de ESMO-richtlijnen is NGS op RNA de aanbevolen methode om RET-fusies aan te tonen.6 Indien NGS niet beschikbaar is, kunnen ook FISH en RT-PCR worden gebruikt, hoewel beide technieken vaak onvoldoende zijn om nieuwe fusiepartners aan te tonen. IHC wordt daarentegen afgeraden vanwege de sterke variatie in kleuring en zwakke immunoreactiviteit van antilichamen gericht tegen RET.
Erik Jan Dubbink: “Tot voor kort was FISH de meest gebruikte methode om RET-fusies aan te tonen en volgens de ESMO-richtlijnen heeft RET-FISH een hoge sensitiviteit en specificiteit. Wij hebben echter in de praktijk gezien dat uitslagen van FISH niet goed overeenkomen met die van NGS van RNA.” Naar aanleiding van de discordante uitslagen tussen FISH en RNA-NGS, hebben Dubbink en collega’s een onderzoek opgezet waarbij tumormateriaal van ruim 4.800 NSCLC-patiënten werd geanalyseerd met FISH.7 Bij 48 patiënten werd een breuk in RET aangetoond met FISH en van dertig patiënten was er voldoende tumormateriaal beschikbaar om de analyse te herhalen met RNA-NGS. Slechts in negen gevallen kon de aanwezigheid van een RET-fusie bevestigd worden met RNA-NGS.
“Uit de resultaten van ons onderzoek blijkt dat RET-FISH in 70% van de gevallen resulteert in een fout-positieve uitslag. Om de reden te achterhalen waarom FISH leidt tot zoveel fout-positieve uitslagen, hebben we vervolgens data van de Hartwig Medical Foundation geanalyseerd van 520 NSCLC-patiënten van wie op tumormateriaal whole genome sequencing was uitgevoerd. Bij negen patiënten was er sprake van afwijkingen in RET, waarbij het maar in vier gevallen om een functionele fusie ging. We konden hieruit concluderen dat niet-functionele afwijkingen in RET relatief vaker voorkomen dan in ALK en ROS1. Hoewel FISH een sensitieve methode is om breuken in RET aan te tonen, is de specificiteit voor RET-fusies laag en zal er altijd een andere techniek gebruikt moeten worden om functionele RET-fusies te detecteren.”
NTRK-fusies
De NTRK-genfamilie bestaat uit NTRK1, -2, en -3 die respectievelijk coderen voor TRKA, TRKB en TRKC. Léon van Kempen: “NTRK-fusies komen voor bij verschillende tumoren, waaronder NSCLC (0,1-3,3%), colorectaal carcinoom (0,2-2,7%), glioblastoom (0,6-1,4%), astrocytoom (3,1%) en schildkliercarcinoom (2,4-25,9%). Daarnaast is er een groep van zeldzame tumoren waarbij NTRK-fusies relatief vaak voorkomen, waaronder speekselkliercarcinoom (75-100%), infantiel fibrosarcoom (50-69%), secretoir mammacarcinoom (66,7-100%) en congenitaal mesoblastisch nefroom (20-91,7%).
NTRK-fusies kunnen op een indirecte manier worden aangetoond met IHC en op een directe manier met FISH, RT-PCR, RNA- of DNA-gebaseerde NGS of andere technieken op RNA, zoals NanoStringTM-analyse.8 Omdat de meest voorkomende NTRK-fusiepartners bekend zijn in veel tumortypen, is RT-PCR een geschikte en eenvoudige optie om de aanwezigheid van bekende NTRK-fusies aan te tonen. Echter, omdat deze analyse beperkt is tot alleen bekende fusietranscripten, kan in het geval van een negatieve uitslag de expressie van een NTRK-fusietranscript niet uitgesloten worden. IHC heeft als voordeel dat naast het aantonen van TRK-eiwitexpressie ook inzicht verkregen wordt in de intratumorheterogeniteit van TRK-expressie, maar richtlijnen voor de interpretatie van de kleuring ontbreken. Bovendien is de sensitiviteit van IHC met het CE-IVD pan-TRK-antilichaam van Roche/VentanaTM niet erg hoog, namelijk 88% voor NTRK1, 89% voor NTRK2 en slechts 54% voor NTRK3.”9
Volgens het diagnostische algoritme dat werd gepresenteerd door Van Kempen is het aanbevolen om pan-TRK-IHC te gebruiken als pre-screeningsmethode bij frequent voorkomende tumoren met een lage prevalentie van NTRK-fusies waarvoor geen standaard multiplex fusietranscriptanalyse wordt uitgevoerd, zoals bij colorectaal carcinoom.9 Een positieve uitslag dient vervolgens bevestigd te worden met RNA-fusietranscriptanalyse. De analyse van RNA-fusietranscripten is daarentegen de aanbevolen methode bij verschillende tumoren. Hieronder vallen zeldzame tumoren met hoge prevalentie van NTRK-fusies, tumoren met hoge TRK-expressie maar lage prevalentie van NTRK-fusies (bijvoorbeeld tumoren ontstaan uit neuraal weefsel) en veelvoorkomende tumoren met lage prevalentie van NTRK-fusies waarvoor multiplex fusietranscriptanalyse reeds wordt uitgevoerd (bijvoorbeeld NSCLC en sarcomen).
“Aangezien er meerdere moleculaire technieken geschikt kunnen zijn om NTRK-fusies aan te tonen, is het bij de keuze voor een test ook belangrijk om te kijken welke techniek in de workflow van je laboratorium past. De keuze kan ook vallen op het uitbesteden van de fusietranscriptanalyse aan een gespecialiseerd laboratorium. Daarnaast is het aan te bevelen om bij DNA- en RNA-analyses altijd na te gaan of het gaat om een productieve translocatie, dan wel productieve translatie”, aldus Van Kempen.
Referenties
1. Drilon A, et al. N Engl Med 2020;383:813-24.
2. Wirth LJ, et al. N Engl Med 2020;383:825-35.
3. Drilon A, et al. N Engl Med 2018;378:731-39.
4. Doebele RC, et al. Lancet Oncol 2020;21:271-82.
5. Subbiah V, et al. J Clin Oncol 2020;38:1209-21.
6. Belli C, et al. Ann Oncol 2021;32:337-50.
7. Radonic T, et al. J Thorac Oncol 2021. Accepted for publication.
8. Detectie van fusiegenen: kwaliteitscontrole en nieuwe methodologie. Oncologie Up-to-date 2020;11:30.
9. Van Kempen L, et al. Ned Tijdschr Oncol 2020;17:266-73.
Carmen Paus, MSc, medical writer
Oncologie Up-to-date 2021 vol 12 nummer 2
DEEL DIT ARTIKEL:
