Flowcytometrie behoort tot een van de gangbare methoden om immuunreacties bij kankerpatiënten in kaart te brengen. Sinds kort biedt een vergelijkbare techniek, massacytometrie, ofwel CyTOF, de mogelijkheid om deze immuunreacties op een hoger niveau te karakteriseren. Dr. Juan Garcia Vallejo, universitair docent en principal investigator bij de afdeling Moleculaire Celbiologie en Immunologie van het Amsterdam UMC, locatie VUmc, vertelt waarin flow- en massacytometrie van elkaar verschillen en welke ongeëvenaarde mogelijkheden massacytometrie biedt voor de oncologie, hematologie en verschillende andere disciplines.
Massacytometrie combineert massaspectrometrie met elementen van flowcytometrie en wordt voornamelijk gebruikt voor de ‘diepe’ fenotypering van cellen. De techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door het bedrijf DVS in Toronto, Canada, in nauwe samenwerking met prof. dr. Garry Nolan van Stanford University (Verenigde Staten). In latere instantie werd de techniek door het bedrijf Fluidigm (San Francisco, Verenigde Staten) gekocht en doorontwikkeld.
Net als bij flowcytometrie worden voor massacytometrie cellen gelabeld met antilichamen tegen diverse membraan- en intracellulaire markers, waaronder receptoren, cytokines en transcriptiefactoren. Om er zeker van te zijn dat slechts individuele, levende cellen worden geanalyseerd, worden de cellen ook met markers voor DNA en kapotte cellen geïncubeerd.
“Het belangrijkste verschil tussen flow- en massacytometrie is echter dat de antilichamen voor massacytometrie niet geconjugeerd zijn aan fluoroforen, maar aan isotopen van metalen. Deze isotopen zijn zeldzaam, zeer zuiver, hebben een unieke massa en kunnen met polymeren aan antilichamen worden gebonden. Na met de antilichamen te zijn gelabeld, worden de cellen gefixeerd en vervolgens met een snelheid van 250 cellen per seconde door de massacytometer geanalyseerd. In dit apparaat komen de cellen in eerste instantie in aanraking met heet argonplasma, waardoor de cellen ‘verdampen’ en alle moleculen worden geïoniseerd. Omdat dit bovendien onder vacuüm gebeurt, blijven de geïoniseerde metalen van elke afzonderlijke cel bij elkaar en kunnen vervolgens met een massaspectrometer worden gedetecteerd. Hierbij kunnen de verschillende metalen onder andere door hun specifieke time-of-flight worden onderscheiden. Ten slotte worden de metingen met specifieke software geanalyseerd”, vertelt Juan Garcia Vallejo.
Voor- en nadelen
Een van de commercieel verkrijgbare massacytometers is de Helios van Fluidigm. Garcia Vallejo: “Met dit apparaat kunnen in theorie 135 verschillende isotopen gemeten worden. Momenteel zijn er reeds 38 isotopen voor massacytometrie verkrijgbaar en de verwachting is dat dit aantal snel zal toenemen. Bovendien kunnen individuele celsuspensies met unieke barcodes worden gelabeld, waardoor het bijvoorbeeld mogelijk is om in één meting de cellen van twintig verschillende patiënten te analyseren.
Een ander voordeel van massacytometrie is dat er, naast een omvangrijk aanbod aan direct gelabelde antilichamen, commerciële kits verkrijgbaar zijn waarmee onderzoekers zelf hun antilichamen met metalen kunnen labelen. Daarnaast kunnen met CyTOF de meest uiteenlopende celtypen worden geanalyseerd, van kleine, antigeenspecifieke T-cellen tot grote tumorcellen. In de meeste gevallen passen we de techniek echter toe op mononucleaire cellen uit het perifere bloed van patiënten of de lymfoïde organen van proefdieren.
Overigens is, door het gebruiksgemak van de commerciële massacytometers, voor het meten van deze monsters amper specifieke expertise vereist. Dat is anders voor het analyseren van de resultaten, wat zeker een uitdaging kan zijn en over het algemeen de meeste tijd kost. Verder zijn de kosten van de CyTOF-apparatuur en reagentia vergelijkbaar met die voor flowcytometrie. Wel wordt voor massacytometrie het relatief dure argon gebruikt, wat dus resulteert in een extra kostenpost. Daarnaast kan een complexe meting soms wel één of twee dagen duren, beduidend langer dan nodig is voor een gangbare meting met een flowcytometer.
Waarschijnlijk leent massacytometrie zich dan ook minder goed voor high-throughputanalyses. Daarentegen kost het opzetten en valideren van een uitgebreide fenotypische analyse beduidend minder tijd dan bijvoorbeeld bij complexe analyses met een flowcytometer. Mijns inziens is massacytometrie momenteel de technologie van voorkeur als het gaat om complexe cytologische analyses.”
Onderzoek
De afgelopen jaren heeft massacytometrie zichzelf bewezen als een waardevolle techniek binnen tal van disciplines, waaronder de immunologie, oncologie en hematologie. Een voorbeeld van een succesvolle toepassing van massacytometrie binnen de immunologie en virologie betreft het werk van dr. Evan Newell van het Singapore Immunology Network (Singapore).
“Voor zijn onderzoek naar immuunreacties tegen virussen ontwikkelde Newell een uniek panel van rond de 100, met barcodes gelabelde, tetrameer-metaalconjugaten. Daarmee was hij in staat om bij individuele patiënten de responsen van antigeenspecifieke T-cellen tegen verschillende virussen in kaart te brengen.1 Dezelfde benadering paste hij later toe bij de analyse van adaptieve immuunreacties tegen tumoren”, aldus Garcia Vallejo.
Een ander voorbeeld dat de vele mogelijkheden van massacytometrie aantoont is een recent onderzoek naar de effecten van immunotherapie op de antitumorimmuunreactie bij patiënten met gemetastaseerd melanoom. Hiervoor werd bij twintig patiënten vóór en na twaalf weken immunotherapie met PD-1-remmers, alsmede bij twintig gematchte gezonde donoren, het perifere bloed met massacytometrie onderzocht. De resultaten laten overtuigend zien dat immunotherapie bij melanoompatiënten geassocieerd is met de inductie van een T-celrespons.2 Bovendien bleek de frequentie van CD14+CD16-HLA-DRhi monocyten vóór het starten met de immunotherapie predictief voor de progressievrije en algehele overleving van de melanoompatiënten.
Deze bevindingen werden met conventionele flowcytometrie op het perifere bloed van een onafhankelijk patiëntencohort bevestigd. Op grond van deze resultaten stelden de onderzoekers voor om de frequentie van CD14+CD16-HLA-DRhi monocyten in het perifere bloed mee te laten wegen bij de behandelkeuze bij patiënten met gemetastaseerd melanoom.
Binnen zijn eigen onderzoek past Garcia Vallejo massacytometrie met name toe voor de karakterisering van immuunreacties bij patiënten met onder andere glioblastoom of myelodysplastisch syndroom. Dit laatste onderzoek voert hij uit in samenwerking met internist-hematoloog prof. dr. Arjan van de Loosdrecht van het Amsterdam UMC, locatie VUmc. Daarnaast gebruikt de onderzoeksgroep van Garcia Vallejo massacytometrie om bij kankerpatiënten een voorspellend immuunprofiel voor immunotherapie te definiëren.
Referenties
1. Newell EW, et al. Nat Biotechnol 2013;31:623-9.
2. Krieg C, et al. Nat Med 2018;24:144-53.
Dr. Robbert van der Voort, medical writer
Immunoncologie.nl 2018 vol 2 nummer 3
DEEL DIT ARTIKEL:
