Analyse van boodschapper-RNA uit formalinegefixeerd tumorweefsel vereist een aantal complexe stappen, waarbij het RNA moet worden omgezet in cDNA, dat vervolgens wordt geamplificeerd en gebruikt voor next generation sequencing. Dr. Nienke Solleveld, KMBP in het Leids Universitair Medisch Centrum, Leiden, vertelt over de toepassing van dergelijke assays voor detectie van fusiegenen en benadrukt het belang van kwaliteitscontrole. Dr. Léon van Kempen, KMBP in het UMC Groningen, gaat in op de nieuwe NanoString-technologie. Hiermee kan men de RNA’s inclusief fusiegentranscripten op een PCR-onafhankelijke manier detecteren.
Fusiegenanalyse wordt uitgevoerd om richting te geven aan een histopathologische diagnose of wanneer op zoek wordt gegaan naar markers die de gevoeligheid voor precisiemedicijnen voorspellen. De uitkomst van de test kan eveneens informatie geven over het verloop van een ziekte. Zo kan men denken aan detectie van specifieke chromosoomtranslocaties die een diagnose ondersteunen of een aangrijpingspunt geven voor doelgerichte therapie. Fusiegenen worden gedetecteerd met geavanceerde moleculair biologische technieken.
Fusiegendetectie
Nienke Solleveld ging in op de ervaringen met de Archer FusionPlex Assay, een targeted amplicon-based RNA sequencing assay waarmee gelijktijdig fusies en andere mutaties kunnen worden geïdentificeerd in ruim vijftig kankergerelateerde genen. Binnen de routinediagnostiek op de afdeling Pathologie in het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC) worden drie soorten Archer-panels toegepast: Archer Comprehensive Thyroid and Lung (ACTL) wordt aangevraagd voor targets waartegen medicijnen bestaan, evenals voor de primaire diagnostiek van schildkliercytologie. Verder zijn er Archer Sarcoma (bot en weke delen), dat vooral wordt gebruikt voor diagnostische vraagstellingen, en Archer Solid, met ruim vijftig aan fusies gerelateerde genen in een breed spectrum van carcinomen.
Uitgangsmateriaal is doorgaans met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselblokjes (FFPE, 83%), maar ook cytologisch materiaal (14%) en bij uitzondering histologisch gekleurde weefselcoupes. Nucleïnezuren (RNA en DNA) worden hieruit geïsoleerd met behulp van een gerobotiseerd systeem. RNA wordt vervolgens omgezet in cDNA-fragmenten en voorzien van moleculaire barcodes voor het bepalen van unieke fragmenten en index-barcodes voor monsteridentificatie. “De slimme opzet van een nested PCR met targetspecifieke primers en adapterprimers maakt het mogelijk om onbekende fusiepartners te identificeren,” legt Solleveld uit, “Na een normalisatiestap ‘multiplexen’ we de Archer libraries met de overige DNA-gebaseerde libraries op één chip voor next generation sequencing (NGS). In 2016 zijn we gestart met deze RNA-gebaseerde genfusieanalyse op FFPE-materiaal en inmiddels zijn ruim 1.500 casussen geanalyseerd.” In 18% van de casussen werd een fusie gevonden, in 64% was duidelijk geen sprake van fusies en in de overige casussen was het materiaal ongeschikt (14%) of de uitkomst niet goed te beoordelen (4%). Fusies werden aangetroffen in zowel FFPE (n=250), cytologisch materiaal (n=17) als in histologisch gekleurde weefselcoupes (n=1).
Kwaliteitseisen
Opvallend is de grote variatie tussen monsters wat betreft RNA-kwaliteit en expressieprofielen. “Dat roept de vraag op wat bij deze methode de juiste kwaliteitscriteria zijn. In de eerste plaats moet het aantal neoplastische cellen voldoende zijn, bij voorkeur meer dan 30%. Verder gebruiken we universele genen als indicator voor de kwaliteit van het input-RNA. Het is van belang voldoende dekking te krijgen voor de targets, waarbij het minimaal vereiste aantal DNA-aflezingen (reads) afhankelijk is van de grootte van het panel. Daarnaast moeten er ook voldoende RNA-reads per monster worden verkregen (minimaal 40%) om de kans op de detectie van een fusiegen zo groot mogelijk te maken.”
Het voldoen aan de kwaliteitseisen is volgens Solleveld voornamelijk cruciaal bij een negatieve bevinding. “Je wilt het risico op het missen van een genfusie zo klein mogelijk maken. Wanneer kwaliteitseisen niet worden gehaald, wordt dit aangegeven in het verslag: : ‘geen fusie gevonden, maar valt niet geheel uit te sluiten’. Vindt men ondanks suboptimale kwaliteit wel degelijk een fusie, dan is het zaak uit te zoeken wat de bewijsvoering voor deze fusie is.”
NanoString-methode
Léon van Kempen behandelt de ins en outs van een RNA-capturetechniek uitgevonden door dr. Krassen Dimitrov en dr. Dwayne Dunaway en in 2008 op de markt gebracht door hun bedrijf NanoString Technologies. De NanoString-methode is een RNA-DNA-hybridisatietechniek waarbij RNA-moleculen geïsoleerd uit tumormateriaal reageren met sequentiespecifieke DNA-fragmenten: capture probes en reporter probes. Deze probes binden naast elkaar op het RNA van interesse. Aan het uiteinde van de capture probe zit een biotinemolecuul waarmee het RNA-probecomplex uit het monster geïsoleerd kan worden. De reporter probes hebben aan hun uiteinde een keten van zes fluorescerende groepen in vier mogelijke kleuren (de nanostrings). Door de volgorde van die zes groepen te variëren verkrijgt men dus talloze unieke ‘barcodes’. Elk RNA-molecuul van interesse wordt dus gemerkt door een unieke fluorescente barcode. De RNA-probecompelexen worden via de biotinegroep gebonden aan een oppervlak. Alles wat niet bindt, wordt weggewassen. De complexen zwenken dan als boompjes in de wind alle kanten op, maar dankzij hun negatieve lading kunnen ze door een spanningsveld allemaal in dezelfde richting worden getrokken, evenwijdig aan het oppervlak. De oriëntatie wordt gefixeerd door een tweede biotinebinding, waardoor de fluorescente labels als barcodes afgelezen kunnen worden. De probe waaraan de barcode hangt is ontworpen voor de detectie van een specifiek RNA-molecuul. Door het aantal verschillende barcodes te tellen, wordt het aantal RNA-moleculen van interesse geteld. Uitgaande van 100 ng RNA geïsoleerd uit formalinegefixeerd weefsel dat ten minste 20% tumorcellen bevat, kan op deze PCR-onafhankelijke manier de expressie van RNA, en dus ook dat van fusiegentranscripten, bepaald worden.
De praktijk
Wat heeft de analyse van de 1.540 casussen opgeleverd? “Voor 103 van de 281 gevonden fusies is een druggable target aangetoond, waarbij doelgerichte therapie een mogelijkheid kan zijn, afhankelijk van de klinische status van de patiënt. Het gaat voornamelijk om ALK, RET, NTRK3 en MET exon 14 skipping. We vinden ze terug in niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC), schildklierkanker, cholangiocarcinoom en allerlei andere tumortypen. Uit een onderzoek naar de workflow van DNA- en RNA-sequencing blijkt dat het sequentieel uitvoeren van DNA- en RNA-NGS de efficiëntste strategie is voor het detecteren van mutaties en fusies in NSCLC bij (voormalige) rokers, maar bij mensen die nooit gerookt hebben is het beter om deze bepalingen parallel uit te voeren; deze patiënten laten namelijk meer fusies en MET exon-skipping zien en hebben meer baat bij de kortere doorlooptijd van de parallelle benadering.”1
In samenwerking met NanoString Technologies heeft Van Kempen een panel ontwikkeld voor detectie van fusiegentranscripten in NSCLC, zoals ALK, ROS1, RET, NTRK1-3 en MET exon 14 skipping, waarvoor doelgerichte medicijnen beschikbaar zijn. Als tweede voorbeeld noemt Van Kempen sarcomen, waarbij de detectie van fusiegentranscripten richting kan geven aan de histopathologische diagnose. “Hiervoor is gebruik gemaakt van een reeds ontworpen pan-sarcoma-panel voor de detectie van 174 fusietranscripten ontwikkeld door collega’s in Vancouver, Canada.2 Zelf hebben we onlangs in Groningen het panel getest op materiaal van 120 patiënten en twintig sarcoomtypen. Gecombineerd met de Vancouver-analyse leverde dit bij zes verschillende sarcoomtypen een volledige diagnostische dekking op.”3
Beide platforms zijn in staat om op een snelle manier fusiegentranscripten te detecteren. Maar er bestaan wel duidelijke verschillen. Voor de Archer-methode is het niet nodig om vooraf te weten wat de mogelijke fusiepartner van een gen zou kunnen zijn. Voor de NanoString is dit juist wel belangrijk, omdat probes ontworpen moeten worden tegen het fusiegentranscript. Maar door extra probes toe te voegen (imbalance probes) kunnen wel aanwijzingen verkregen worden voor een fusietranscript zonder identificatie van de fusiepartner. Daarbij is de NanoString flexibeler: een panel kan eenvoudig worden uitgebreid met probes voor nieuwe targets. Wel vereist het een investering in apparatuur, terwijl de Archer-methode draait op NGS-apparatuur die beschikbaar is in laboratoria voor moleculaire diagnostiek. Het grote verschil in kosten per reactie maakt dat de timing van de test verschilt in de moleculaire analyse van NSCLC. Mede afhankelijk van de rokersstatus wordt de Archer-methode in de meeste gevallen uitgevoerd indien met NGS geen drivermutaties zijn aangetoond, terwijl in het UMC Groningen de NanoString-methode gelijktijdig wordt uitgevoerd met de mutatieanalyse voor iedere longkankerpatiënt.
Referenties
1. Cohen D, et al. J Thorac Oncol 2020 Jan 31. [Epub ahead of print]
2. Chang KT, et al. J Mol Diagn 2018;20:63-77.
3. Song W, et al. Genes Chromosomes Cancer 2020;59:318-24.
Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapsjournalist
Oncologie Up-to-date 2020 vol 11 nummer 3
DEEL DIT ARTIKEL:
