CRISPR-Cas, een nieuwe methode waarmee DNA relatief snel, gemakkelijk en met ongekende precisie kan worden gemodificeerd, bewijst inmiddels ook haar nut in het kankeronderzoek. Dr. Jarno Drost, moleculair bioloog, Prinses Máxima Centrum voor kinderoncologie te Utrecht, legde uit hoe deze technologie ontstond en wat deze betekent voor zijn onderzoek naar het ontstaan van darmkanker. “In combinatie met de techniek van het maken van colonorganoïden uit stamcellen kunnen we hiermee fysiologische relevante tumormodellen genereren waarmee we de verschillende stadia van de ziekte kunnen bestuderen.”
Al vrij snel na de ontdekking van de DNA-helix in de jaren vijftig van de vorige eeuw begon men technologieën te ontwikkelen om veranderingen te introduceren in specifieke genen (mutaties), om zo inzicht te krijgen in de betrokkenheid van die genen bij bepaalde ziektebeelden. Dat bleek gemakkelijker gezegd dan gedaan. “Pas in de jaren negentig slaagden onderzoekers erin via homologe recombinatie mutaties aan te brengen in embryonale stamcellen van muizen,” vertelt Jarno Drost, tot voor kort werkzaam als moleculair bioloog in het Hubrecht Instituut te Utrecht en tegenwoordig als groepsleider in het Prinses Máxima Centrum voor kinderoncologie. “Het langs deze weg maken van transgene muizen was een grote doorbraak, maar met de kennis van nu was het een inefficiënte, kostbare en langdurige procedure. Jaren later werden de zinc-finger-nucleases (ZFN’s) en transcription-activator-like effectornucleases (TALEN’s) ontdekt, DNA-nucleases om in specifieke regio’s van het genoom te knippen. Maar die methodiek is complex en het is extreem lastig gebleken om voor bepaalde DNA-regio’s adequate ZFN’s of TALEN’s te ontwikkelen.”
Moleculair adaptief afweersysteem
CRISPR staat voor clustered regularly interspaced short palindromic repeats.
Deze DNA-repeats werden in 1987 voor het eerst beschreven door Japanners, in E. coli-bacteriën. Begin jaren negentig ontdekte Francisco Mojica in het Spaanse Alicante vergelijkbare repeats in Archaea. Ook dr. Ruud Jansen, destijds werkzaam in Utrecht, merkte de repeats op: ze bleken gewoonlijk naast een serie genen te liggen die leken te coderen voor enzymen. Mojica ontrafelde vervolgens dat het bij de segmentjes die afwisselden met de repeats (spacers) ging om viraal DNA. Jansen en hij besloten dit onderbroken repeatfenomeen CRISPR te noemen. Mojica zag als eerste in dat het zou kunnen gaan om een adaptief afweersysteem tegen viraal DNA: het CRISPR-associated system, ofwel Cas. Toptijdschriften waren sceptisch, maar uiteindelijk kreeg hij zijn idee in 2005 gepubliceerd in het Journal of Molecular Evolution.
In datzelfde jaar leverden Amerikaanse en Canadese onderzoekers het bewijs: yoghurtbacteriën waren resistenter tegen bacteriofagen als ze meer faag-DNA in hun genoom hadden opgenomen. Ook had men een reeks ‘cas-genen’ bestudeerd: cas7 was nodig voor het ‘downloaden’ van de faagcode in het bacteriegenoom, zodat er van elk virus een ‘vingerafdruk’ werd opgeslagen, en cas9 voor de aanval op faag-DNA waarvan de vingerafdruk was herkend.
CRISPR genome editing
De van origine Franse prof. dr. Emmanuelle Charpentier (Max Planck Instituut voor Infectiebiologie, Berlijn, Duitsland) en de Amerikaanse prof. dr. Jennifer Doudna (Universiteit van Californië, Verenigde Staten) toonden in 2012 gezamenlijk aan dat Cas9 in feite kan worden gebruikt om op geselecteerde plekken dubbelstrengsbreuken te geven. Men moet het enzym daartoe voeden met de gewenste RNA-code: een in het lab gefabriceerd gids-RNA (single guide RNA of sgRNA, een soort fusie van crRNA en tracrRNA) dat zowel doelwit-DNA herkent als kan binden aan Cas9.
Ook bleek dat dit systeem kan worden toegepast in eukaryotische (lichaams)cellen. “Zodra het complex bindt aan het doelwit-DNA, wordt dit DNA ter plekke geknipt,” legt Drost uit. “De cel gaat dit vervolgens repareren, hetzij door de twee uiteinden aan elkaar te ligeren (een proces dat zeer gevoelig is voor fouten en mutaties oplevert die het gen kunnen inactiveren), hetzij via homologe recombinatie (dit vereist de aanwezigheid van de intacte DNA-keten van het zusterchromosoom). In dat laatste geval wordt de intacte DNA-keten gebruikt als blauwdruk voor de reparatie van de geknipte keten. Dit proces kan worden gefopt door de blauwdruk zelf aan te leveren. Op die manier kun je heel gericht een mutatie aanbrengen, maar, als het doel-DNA een mutatie bevat, een gemuteerd gen ook weer terugbrengen naar het wildtype.”
Er zijn inmiddels allerlei varianten van Cas9 ontwikkeld, bijvoorbeeld een variant die slechts één van de twee strengen knipt. Ook zijn er varianten die geen enzymatische activiteit meer hebben, maar die kun je fuseren met bepaalde eiwitten, die je zo kunt rekruteren naar specifieke plekken in het genoom. Sinds de ontwikkeling van de CRISPR genome editing zijn er gigantisch veel publicaties rond deze technologie verschenen: de aandacht is echt verschoven van RNA-interferentie naar de CRISPR-Cas.”
Naar organoïden en CRISPR-Cas
Zelf gebruikte Drost de CRISPR-Cas-technologie als postdoc bij prof. dr. Hans Clevers in het Hubrecht Instituut om colonkankermodellen te maken uit humane darmstamcellen. In 2007 werd in Clevers’ lab door dr. Nick Barker het eiwit Lgr5 ontdekt als marker voor dunnedarmstamcellen. Transgene muizen met een gen voor groen-fluorescerend proteïne (GFP) in het Lgr5-locus vertoonden oplichtende cellen op de bodem van de crypten die alle gedifferentieerde cellen van de dunne darm konden produceren.
Een aantal jaar later slaagde postdoc dr. Toshiro Sato erin deze Lgr5-positieve cellen in aanwezigheid van essentiële stamcelfactoren als Wnt, R-spondine, EGF en Noggin te laten uitgroeien in kweekschaaltjes in een artificiële extracellulaire matrix. Er ontstaan zo zogeheten organoïden die de dunnedarmarchitectuur behouden en waarin onderin de ‘crypten’ de stamcellen zijn gelokaliseerd. Sindsdien zijn er humane organoïden ontwikkeld voor onder andere dunne darm, dikke darm, lever, long, pancreas, prostaat, ovarium, borstklieren, oesofagus, maag en speekselklier.
Drost: “Bekend was dat inactiverende mutaties in de genen APC, p53 en Smad4 en activerende in RAS een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van darmkanker. Gezien de genetische instabiliteit van colonkanker is het echter lastig vast te stellen welke mutaties wanneer betrokken zijn bij de initiatie en progressie van de ziekte. Colonkankercellijnen zijn doorgaans ontwikkeld uit metastasen en daarin zijn alle mutaties al aanwezig. Verder maakte men tot nu toe gebruik van technieken als RNA-interferentie om de expressie van oncogenen te manipuleren, maar dat weerspiegelt beslist niet de situatie in tumoren.
Organoïden leken ons het ideale alternatief voor cellijnen, omdat deze zowel fenotypisch als genetisch buitengewoon stabiel zijn, en RNA-interferentie hebben we ingeruild voor CRISPR-Cas9 genome editing om mutaties te introduceren die ook in tumorcellen voorkomen. Daartoe hebben we sgRNA’s ontwikkeld tegen APC, RAS, p53 en Smad4 en gebruikgemaakt van een methode waarbij we de compositie van het kweekmedium veranderen om de gewenste mutanten te selecteren. Zo hebben we vier sgRNA’s gemaakt gericht tegen exon 15 in het APC-gen (exon 15 is een bekende hotspotregio van mutaties). Zodra je hier frameshiftmutaties introduceert, krijg je APC-varianten die ook worden aangetroffen in tumorweefsel van patiënten. Ook hebben we allerlei combinaties van mutaties in APC, RAS, p53 en Smad4 geïntroduceerd, zelfs een viervoudige mutant die groeit in afwezigheid van alle groeifactoren. Vervolgens hebben we gekeken naar onder andere chromosoominstabiliteit (een belangrijk kenmerk van colontumoren); die bleek met name bij viervoudige mutanten opvallend hoog.”
Een volgende stap was het subcutaan implanteren van organoïden bij immuundeficiënte muizen. Drost: “De tripelmutant RAS–APC-p53 produceerde in 25% van de gevallen kleine, relatief goedaardige tumoren, maar met een gemuteerd Smad4 erbij werden dat in 80% van de gevallen grote, invasieve tumoren. In samenwerking met prof. dr. Jacco van Rheenen (Hubrecht Instituut) is ook gewerkt aan een tumormodel voor metastasering. Het blijkt dat voor dit proces alle vier de genen gemuteerd dienen te zijn – deze organoïden groeien onafhankelijk van groeifactoren en kunnen dus in een orgaan gedijen, wat metastasering en groei in andere organen mogelijk maakt.
Verder onderzoeken we de gevolgen van de uitschakeling van MLH1, een gen dat betrokken is bij mismatch DNA repair: in de MHL1-deficiënte organoïden monitoren we hoe hierin mutaties accumuleren om op die manier te achterhalen welke mutaties noodzakelijk zijn voor het ontstaan van mismatch-repairdeficiënte colontumoren. En in samenwerking met prof. dr. Jan Paul Medema (Academisch Medisch Centrum, Amsterdam) hebben we met CRISPR-Cas9 de BRAFV600E-mutatie geïnduceerd om te bestuderen hoe hieruit in het colon serrated adenocarcinomen ontstaan.”
Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapsjournalist
Oncologie Up-to-date 2017 vol 8 nummer 2
Uitgelezen systeem
Zodra viraal DNA in de bacterie terechtkomt, slaagt de bacterie erin om middels het zogeheten adaptatiecomplex korte fragmenten van het virale DNA (protospacers) in het CRISPR-locus te incorporeren, steeds vergezeld door een repeatsequentie. Op een gegeven moment draagt de bacterie dus talloze genoomfragmenten van virussen die de bacterie ooit hebben aangevallen. Die sequenties worden omgezet in RNA, zogeheten crRNA’s. Ze bestaan deels uit de virale code (ongeveer 20 nucleotiden lang) en een repeatdeel. Dat laatste gaat een interactie aan met zogeheten tracrRNA, dat wordt herkend door en zich bindt aan Cas9-endonuclease. Dit Cas9-tracrRNA:crRNA-effectorcomplex screent het virale DNA zodra dit tijdens een infectie naar binnen wordt gebracht. Zodra de bewuste twintig nucleotiden het virale deel van het crRNA paren met het bedreigende virus-DNA, geeft het Cas9-enzym een dubbelstrengsbreuk en inactiveert zo het virale DNA.
Een belangrijke ontdekking was dat Cas9 in eerste instantie zoekt naar een korte sequentie in het virale genoom met daarin altijd twee aangrenzende guanines. Protospacers worden namelijk alleen geknipt naast zo’n protospacer adjacent motif (PAM). De affiniteit van de PAM-sequentie voor structuren op Cas9 dient ook als een soort schoenlepel om het virale DNA toegankelijk te maken voor het crRNA. De spacers in het bacteriechromosoom missen PAM-sequenties, dus het CRISPR-locus blijft zo gevrijwaard van DNA-schade door Cas9.
DEEL DIT ARTIKEL:
