Sinds 2016 is er een nieuwe WHO-classificatie beschikbaar voor tumoren in het centrale zenuwstelsel. De indeling van deze tumoren berustte gedurende ongeveer een eeuw op microscopie, maar tegenwoordig is er een grote rol voor moleculaire diagnostiek. Dr. ir. Wendy de Leng, KMBP in het UMC Utrecht, besprak de betekenis van DNA-methylering in de neuro-oncologische tumorclassificatie en hoe methyleringsprofielen kunnen worden gegenereerd en geduid. Vervolgens ging Loudy Priesterbach-Ackley, aios en onderzoeker moleculaire pathologie in het UMC Utrecht, in op de moleculaire diagnostiek van diffuse gliomen.
DNA-methylering, het enzymatisch toevoegen van een methylgroep aan een cytosine (C), waardoor een methylcytosine wordt gevormd, is een van de belangrijkste epigenetische processen. In de regel vindt deze methylering alleen plaats als de cytosine wordt gevolgd door een guanine (G): de cytosinefosfaatguanine(CpG)-sequentie, die relatief vaak voorkomt in promotorgebieden van genen (CpG-eilanden). De methylgroepen verhinderen de toegankelijkheid voor transcriptiefactoren en DNA-methylering speelt zo een cruciale rol in weefselspecifieke genexpressie. Inmiddels is duidelijk dat aberrante methylering een belangrijke en vroege factor is in tumorontwikkeling en -progressie. Methyleringspatronen blijken in verschillende tumortypen te verschillen, waardoor ze kunnen fungeren als tumorspecifieke vingerafdrukken (zie Kader voor een uitleg van de technologie waarmee methyleringspatronen tegenwoordig worden bepaald).
Wendy de Leng besprak de betekenis van methylering voor de classificatie van centraalzenuwstelsel (CZS)-tumoren. In het UMC Utrecht wordt methylation profiling (MP) toegepast op hersentumoren bij volwassenen die lastig classificeerbaar zijn op basis van histologie, of die een onverwacht klinisch beloop vertonen. Tevens worden nu, met de komst van het Prinses Máxima Centrum voor kinderoncologie in Utrecht, alle pediatrische hersentumoren geanalyseerd. Bij bijvoorbeeld medulloblastomen en ependymomen kan zo’n moleculaire subclassificatie zeer relevant zijn.
Veelzijdige toepassing
Naast tumorclassificatie kan MP ook informatie geven over bepaalde vormen van copynumbervariaties (moleculaire verandering waarbij DNA ontbreekt of juist te veel aanwezig is), over de methyleringsstatus van relevante genen en, indirect, ook over de mutatiestatus van een aantal specifieke genen. Volgens De Leng is MP een buitengewoon nuttige en relatief kosteneffectieve methode om moeilijk te classificeren CZS-tumoren beter te diagnosticeren, met name wanneer moleculaire informatie nodig is voor bijvoorbeeld verdere behandeling. Wel moeten voor een optimale diagnose de resultaten van zo’n MP-analyse altijd worden gecombineerd met histologische, radiologische en klinische gegevens.
IDH-status en 1p/19q-deleties
Gliomen zijn woekeringen van (voorlopers van) steuncellen in de hersenen: astrocyten en oligodendrocyten. Moleculaire diagnostiek heeft hierbij geleid tot een belangrijke herindeling. Er zijn zowel diagnostische markers die helpen om specifieke tumorgroepen te identificeren, als markers die helpen de prognose te bepalen of de respons op een bepaalde behandeling te voorspellen. Loudy Priesterbach besprak de implementatie van de WHO-classificatie uit 2016 voor met name diffuse gliomen bij volwassenen.
Voor een indeling in de grootste groepen gliomen zijn twee moleculaire kenmerken van belang: mutaties in IDH1/2 en de status van de korte arm van chromosoom 1 en de lange arm van chromosoom 19 (1p/19q).
IDH1/2-mutaties komen in hoge frequentie voor in graad II/III diffuse astrocytomen en oligodendrogliomen, en in lage frequentie in glioblastomen (waarbij het dan vermoedelijk gaat om een secundaire vorm uit astrocytoom graad II/III): deze hebben een betere prognose dan een glioblastoom zonder de mutatie. In 90% gaat het om IDH1-mutatie R132H, die inmiddels ook is aan te tonen met immuunhistochemie.
Codeletie van 1p en 19q is een obligate moleculaire afwijking voor de diagnose van prototype oligodendroglioom. De voorkeursmethode om dit aan te tonen is volgens Priesterbach de detectie van single nucleotide polymorfismen (SNP’s). Ze raadt af om hiervoor de klassieke fluorescentie-in-situhybridisatie te gebruiken. Oligodendrogliomen hebben ook een IDH-mutatie en de prognose van deze patiënten is relatief goed.
Verder zijn bij gliomen mutaties in de genen ATRX, TP53 en de TERT-promotor een relevante ondersteuning voor het stellen van de diagnose en prognose. High-level EGFR-amplificatie, verhoging van chromosoom 7 en verlies van chromosoom 10, en TERT-promotormutatie zijn markers die helpen bij het stellen van de diagnose glioblastoom. Hypermethylering van de promotor van het gen dat codeert voor het DNA-reparatie-enzym methylguanine-methyltransferase (MGMT) is zowel een indicator voor een betere prognose als voorspellend voor respons op temozolomide, een middel dat DNA-schade veroorzaakt en wordt gebruikt bij glioblastoom.2
Volgens de huidige WHO-classificatie Neuro-oncologie zijn moleculaire bepalingen dus vrijwel altijd noodzakelijk voor optimale diagnostiek. Wel berust het onderscheid tussen de verschillende diagnosen vaak op meerdere moleculaire afwijkingen en meestal zijn daar verschillende technieken voor nodig. Kiest men voor een combinatie van next generation sequencing en methyleringsspecifieke multiplex ligation-dependent probe amplification of MP, dan kan men volgens Priesterbach vrijwel alle benodigde informatie krijgen voor een adequate CZS-tumordiagnostiek.
Referenties
1.Capper D, et al. Nature 2018;555:469-74.
2. Brat DJ, et al. Acta Neuropathol 2018;136:805-10.
Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapsjournalist
Oncologie Up-to-date 2019 vol 10 nummer 2
DEEL DIT ARTIKEL:
Detectie van DNA-methylering met BeadChip-technology
Voor het bepalen van DNA-methyleringspatronen maakt men gebruik van de Infinium MethylationEPIC beadchip-850K (Illumina). Dit is een glaasje met meer dan 850.000 keurig gerangschikte micro-wells, met in elke well een bolletje waaraan unieke DNA-sequenties (probes) zijn gehecht die vlak voor een CpG-site eindigen. De assay maakt gebruik van het gegeven dat de base C in de te analyseren DNA-fragmenten door bisulfiet kan worden omgezet in de RNA-base uracil (U), maar niet als de C is gemethyleerd. Tijdens een amplificatiestap worden de U’s vervangen door de DNA-base thymine (T). De geamplificeerde (enkelstrengs) DNA-fragmenten laat men nu met de aan de bolletjes gehechte probes hybridiseren. Vervolgens worden de probes verlengd (met de hiertegen gehybridiseerde DNA-fragmenten als template) met één nucleotide: C paart dan met de toegevoegde G, T met toegevoegde A. De toegevoegde G is groen fluorescent gelabeld, A is rood gelabeld, dus de bolletjes kleuren rood of groen, afhankelijk van of de betreffende CpG-plaats al of niet was gemethyleerd.
Er wordt een foto gemaakt van het glaasje en deze wordt met speciale software geanalyseerd. In Heidelberg, Duitsland, is een methylation profiling classifier ontwikkeld waarmee circa negentig verschillende CZS-tumoren op basis van hun methyleringsprofiel onderscheiden kunnen worden.1 Inmiddels is er ook zo’n classifier beschikbaar voor sarcomen.