Mutatieanalyse op celvrij DNA dat circuleert in het bloed van kankerpatiënten ontwikkelt zich snel als onderzoeksgebied dat mogelijkheden opent voor diagnose, patiëntselectie voor doelgerichte therapie en monitoring van respons op therapie. Prof. dr. Ed Schuuring, klinisch moleculair bioloog in de pathologie aan het UMC Groningen, schetst de mogelijkheden en uitdagingen.
Celvrij DNA circulerend in het bloed (cell free DNA; cfDNA) kan afkomstig zijn van een tumor ten gevolge van necrose en er is een verband tussen de hoeveelheid cfDNA en het tumorvolume bij de patiënt. Een meta-analyse van studies waarin cfDNA was bepaald in plasma van patiënten met niet-kleincellig longkanker (NSCLC) liet echter aanzienlijke verschillen zien in specificiteit (variërend van 47-100%).1 Schuuring: “Er worden veel verschillende analysemethoden gebruikt en verder zijn er aanzienlijke DNA-concentratieverschillen tussen diverse soorten kanker. Wij concentreren ons op longkanker en gastro-intestinale stromatumoren (GIST) en vonden hierin variaties van respectievelijk 9-19 en 4-25 nanogram DNA per milliliter plasma.”
Standaardisatie
Er zijn echter andere oorzaken voor (verhoogde) cfDNA-waarden in het plasma waargenomen, zoals ontstekingen, lichamelijke inspanning, zwangerschap en elke vorm van celdodende therapie. Maar ook hemolyse in het buisje kan een belangrijke verstorende factor zijn. “Bloed wordt verzameld in standaardbloedbuizen die EDTA bevatten”, legt Schuuring uit. “Na de bloedafname worden bij lage snelheid voorzichtig alle bloedcellen afgedraaid en daarna wordt het supernatant bij hoge snelheid van verontreinigingen ontdaan. Uit de literatuur en vanuit onze ervaring weten we dat, om hemolyse te voorkomen, deze centrifugestappen binnen vier uur na bloedafname dienen te geschieden, maar daar bestaat momenteel geen consensus over.”
Eigenlijk ontbeert de hele procedure een degelijke standaardisatie, wat maakt dat bestaande plasmabiobanken voor deze analyse niet echt geschikt lijken. Verder is de procedure tamelijk tijdrovend en arbeidsintensief en (nog) niet geschikt voor automatisering. Daarnaast is veel vriezercapaciteit nodig. Schuuring: “In Groningen loopt een studie waarbij momenteel bij alle longkankerpatiënten bloed wordt afgenomen vóór en 2, 6, en 12 weken na de behandeling. Dat worden in totaal 54.000 1 ml-buizen in één jaar!”
Bij gebrek aan tumorweefsel
Voor longkanker is het weefselbiopt de gouden standaard om in de routinepathologie zowel de diagnose als de behandelkeuze te kunnen vaststellen. Bijvoorbeeld of er sprake is van mutaties in het EGFR-gen, omdat deze patiënten in aanmerking komen voor specifieke EGFR-remmers. Toch is biopteren van de longnoduli niet altijd een optie (ze zijn te klein of te diffuus of liggen te dicht bij het hart of een vitaal bloedvat). Bovendien bevat het biopt in 15-25% van de gevallen geen of onvoldoende representatief tumorweefsel. Hier kan plasma-cfDNA dus uitkomst bieden en er bestaat inmiddels aanzienlijke ervaring met de detectie van EGFR-mutaties in cfDNA. Uit een meta-analyse van twintig studies bleek een gezamenlijke specificiteit van 92,2% en sensitiviteit van 69,1%.2
Sinds juli vorig jaar is in de Nederlandse richtlijn voor het NSCLC opgenomen dat de EGFR-mutatietest (en ook tests voor een aantal andere genen) mag worden uitgevoerd op circulerend tumor-DNA uit plasma indien er geen geschikt biopt beschikbaar is. Dat zet natuurlijk extra druk op de klinische validatie van nieuwe tests. Schuuring: “We vergelijken nu digital droplet-PCR (ddPCR), next generation sequencing (NGS) en commerciële systemen, zoals cobas-EGFR en Idylla voor de detectie van de therapiegerelateerde mutaties. Onze eerste resultaten met cobas-EGFR laten een zeer acceptabele specificiteit en sensitiviteit zien.”
Monitoring
Een andere toepassing is klinische monitoring van de respons van een tumor op therapie. Bij een goede respons zal een afname van therapiegerelateerde mutaties in het cfDNA worden waargenomen. Bij progressie zullen dergelijke mutaties in het cfDNA weer toenemen, vaak voordat de progressie zich manifesteert op de CT-scan, waardoor men wellicht sneller kan overschakelen op een alternatieve therapie. Schuuring liet onder andere een recente Italiaanse studie zien waarin bij een deel van de NSCLC-patiënten onder behandeling van een TKI, EGFR-mutaties (gemeten met cobas-EGFR) binnen drie weken geheel waren verdwenen. Bij anderen bleef de hoeveelheid gemuteerd EGFR constant.3
In de Nederlandse GALLOP-studie, die vanuit het UMCG wordt gecoördineerd en wordt gefinancierd door KWF-Alpe d’HuZes, worden bij GIST-patiënten KIT-mutaties bepaald in tumor-DNA en plasma-cfDNA, en gecorreleerd aan plasmaconcentraties imatinib. “We richten ons op patiënten met imatinibgevoelige mutaties in exon 11 van het KIT-gen. Er zijn nu 28 GIST-biopten geanalyseerd met NGS en een gevoelige drop-off ddPCR-test en in liefst 27 gevallen geven beide methoden dezelfde uitkomst. De eerste gegevens met deze nieuwe ddPCR-test in plasma-cfDNA laten de mutatie zien bij zes van de zestien patiënten (wat overeenkomt met gegevens uit de literatuur) én in die gevallen met een mutatie was er een afname van plasma-cfDNA na zes weken behandeling. Het percentage mutaties in cfDNA kan per tumor trouwens sterk verschillen en correleert duidelijk niet met het tumorvolume.”
Externe kwaliteitscontrole
Schuuring denkt dat de gevoeligheid van dit soort tests nog sterk kan verbeteren. Een interessante methode is het creëren van duizenden nanodruppeltjes in een buisje geïsoleerd DNA (water-olie-emulsie), vervolgens PCR-reacties te laten plaatsvinden binnen de afzonderlijke druppeltjes en die met flowcytometrie te analyseren. “We konden bevestigen dat deze kwantitatieve ddPCR-technologie een enorme verhoging geeft van de gevoeligheid. Maar het is ook belangrijk dat een analysemethode kwantitatief stabiel is. Met name voor therapiemonitoring dient zo’n methode robuust te zijn. Verder zijn er goede controle- en referentiemonsters nodig.
We zijn binnen de European Society of Pathology een werkgroep gestart die zich richt op het maken van controlemonsters die gebruikt zullen worden voor een pilotprogramma voor external quality assessment van het International Quality Network for Pathology (EQA-IQNPath). Hiervoor zullen we in eerste instantie dertig Europese laboratoria selecteren. In juni organiseren we een workshop om te komen tot een Europese consensus over hoe men het beste bloedmonsters kan opwerken en opslaan, en DNA moet extraheren.
Overigens maakte de firma Illumina onlangs bekend dat het bedrijf, gesponsord door investeerders als Bill Gates en Jeff Bezos, het programma GRAIL gaat starten met als doel de ultieme screeningstest op bloed te ontwikkelen voor alle vormen van kanker. De ontwikkelingen gaan hard!”
Referenties
1. Ulivi P, et al. Cell Oncol 2013;36:439-48.
2. Luo J, et al. Sci Rep 2014;4: 6269.
3. Marchetti A, et al. J Thorac Oncol 2015;10:1437-43.
Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapsjournalist
Oncologie Up-to-date 2016 vol 7 nummer 2
DEEL DIT ARTIKEL:
