BRCA1 en -2 zijn cruciaal voor het foutloos herstellen van dubbelstrengs-DNA-breuken via het proces van homologe recombinatie (HR). Tumorcellen met een defecte HR zijn uiterst gevoelig voor antikankerbehandelingen die DNA-breuken induceren. Voortschrijdend preklinisch onderzoek naar onderliggende mechanismen heeft inmiddels belangrijke gevolgen voor de inzet van platinumbevattende medicijnen en de onlangs ontwikkelde PARP-remmers. Deze therapeutische consequenties zullen weer impact hebben op de wijze waarop wordt getest op BRCA1-/-2-mutaties. Zo lijkt het bij ovariumcarcinoom efficiënter eerst de tumor zelf te analyseren en pas bij positiviteit informed consent te vragen voor een bloedtest op kiembaanmutaties. Daartoe is nu een mutatietest ontwikkeld met grotere gevoeligheid en betrouwbaarheid dan gangbare methodieken. Omdat mutaties in mogelijke andere genen ook kunnen leiden tot HR-deficiëntie, is tevens een methode ontwikkeld die de genomische gevolgen van het BRCAness-profiel analyseert. Bovendien is het nu mogelijk ex vivo na te gaan in hoeverre DNA-herstel via HR nog daadwerkelijk in tumorcellen functioneert.
In 2005 lieten twee onderzoeksgroepen in Nature onafhankelijk van elkaar zien dat inactivering van een DNA-herstelmechanisme voor enkelstrengs-DNA-breuken dodelijk is voor BRCA-gemuteerde tumoren.1,2 Het mechanisme is als volgt: zodra enkelstrengsbreuken in de DNA-synthesefase van de celcylcus de ‘replicatievork’ ontmoeten, stort deze vork ineen en laat een dubbelstrengsbreuk achter. Zonder homologe recombinatie (HR) kunnen dubbelstrengsbreuken alleen op een foutgevoelige manier worden hersteld en dat leidt tot cellulaire stress en apoptose. Dat laatste wordt gestimuleerd door activering van het tumorsuppressoreiwit p53. In BRCA-gemuteerde tumorcellen is p53 daarom vaak geïnactiveerd, waardoor deze cellen blijven delen ondanks de zich ophopende DNA-schade.
Het enzym dat enkelstrengsbreuken signaleert, is poly(ADP-ribose)polymerase (PARP). Hiertegen zijn diverse farmacologische remmers ontwikkeld. “We hadden het gevoel met PARP-remming een ideale tumorcelselectieve therapie met beperkte bijwerkingen in handen te hebben,” zegt prof. dr. Jos Jonkers, hoofd van de sectie Moleculaire Pathologie in het Nederlands Kanker Instituut te Amsterdam. “Klinische data suggereerden vervolgens een sterk, maar ook zeer heterogeen effect. Zo liet een fase 2-proof-of-conceptstudie met de orale PARP-remmer olaparib bij patiënten met BRCA1-/-2-gerelateerde borstkanker zowel goede responsen zien als géén respons, wat suggereert dat ook andere factoren dan de BRCA-status een rol spelen.”3
Mutaties in kaart
Jonkers’ lab ontwikkelde een functionele test met genetisch gemakkelijk te modificeren embryonale stamcellen (ES) van muizen om snel te kunnen toetsen of missensevarianten (eiwitveranderende varianten) van het humane BRCA1-gen pathogeen zijn. “We hebben het Brca1-gen van de muis uitgeschakeld en vervolgens steeds andere varianten van humaan BRCA1 ingebracht om te zien in hoeverre deze de functie konden overnemen.” Uit de experimenten bleek dat alle schadelijke mutaties liggen in de zogeheten RING- en BRCT-domeinen aan beide uiteinden van het BRCA1-gen. “En dat zijn nou net de domeinen waaraan allerlei nucleaire eiwitfactoren binden.”
Effectieve combinatietherapie
Een ander onderzoeksthema is de vraag in hoeverre BRCA-mutaties therapeutisch kunnen worden benut. Daartoe maakt Jonkers gebruik van genetisch gemodificeerde muizenmodellen. Via dezelfde ES-route zijn in Brca1 zogeheten conditionele mutaties aangebracht, dat wil zeggen dat men Brca1 uitsluitend uitschakelt in mammaweefsel. Indien ook p53 ontbreekt, ontstaan daarin na circa acht maanden mammatumoren die sterk lijken op BRCA-negatieve borstkanker.4 Jonkers: “Zoals te verwachten zijn deze tumoren uiterst gevoelig voor cisplatine en PARP-remming, al keren ze na zo’n complete respons wel altijd weer terug. Opmerkelijk genoeg ontwikkelen ze geen enkele resistentie tegen cisplatine, terwijl ze juist razendsnel resistent worden tegen PARP-remming.”5
Zijn eerste streven was het vinden van optimale combinaties van platinumbevattende medicijnen en PARP-remmers. “De combinatie van cisplatine en olaparib gaf bij ons muizenmodel weliswaar een langere overleving dan elk middel afzonderlijk, maar ook verhoogde toxiciteit. De effectiefste therapie kwam neer op een initiële behandeling met cisplatine om het tumorvolume maximaal te reduceren, gevolgd door honderd dagen onderhoudstherapie met olaparib. In die honderd dagen zagen we geen tumoruitgroei, wel na het stoppen van de behandeling. Die recidieven bleven trouwens gevoelig voor cisplatine, maar toxiciteit was een beperkende factor, wat pleit voor chronische PARP-remming.”
Deze preklinische data hebben in 2008 mede geleid tot een fase 2-studie naar onderhoudstherapie met olaparib bij patiënten met carboplatinegevoelig ovariumcarcinoom. Vanwege de spectaculaire uitkomst van deze studie kreeg olaparib in 2014 zowel FDA- als EMA-goedkeuring voor patiënten met BRCA1-gemuteerde ovariumkanker.6
Modellen voor resistentie
Op moleculair niveau werkte de groep van Jonkers verder aan de vraag welke BRCA1-functies nodig zijn voor de ontwikkeling van cisplatineresistentie. “Eigenlijk bootst een tumormodel waarin grote delen van het Brca1-gen zijn gedeletet niet goed de klinische situatie na, want gemuteerd BRCA1 kan soms restactiviteit vertonen. Daarom hebben we muizenmodellen ontwikkeld met drie mutaties die bij de mensen prevaleren, in het RING-gebied (185delAG en C61G) en in het BRCT-gebied (5382insC). Alle mutanten zijn embryonaal letaal en geven, conditioneel tot expressie gebracht, snelle vorming van tumoren die identiek zijn aan tumoren zonder BRCA1, maar onderling duidelijk verschillen in respons op therapie. C61G- en 185delAG-tumoren reageren slecht op cisplatine en olaparib en dat lijkt samen te hangen met een aanzienlijke mate van HR-functie. 5382insC-tumoren zijn daarentegen net zo gevoelig voor cisplatine en olaparib als BRCA1-loze tumoren. 185delAG-tumoren blijken een RING-loos BRCA1 te produceren en we denken nu dat therapieresistentie kan worden geïnduceerd door expressie van dit RING-loze eiwit.”
Promotormethylering
Duidelijk is dat de BRCA1-/-2-mutatiestatus alléén niet volstaat om de gevoeligheid voor bepaalde antikankermiddelen te voorspellen, maar dat hierin nog veel meer factoren een rol spelen. “Naast het uitschakelen van BRCA1 door mutaties kan er ook sprake zijn van hypermethylering van de BRCA1-promotor, waardoor het gen niet tot expressie komt. Werk in ons laboratorium met patient-derived xenograft (PDX)-modellen – het subcutaan laten groeien van humane tumorbiopten bij immuundeficiënte muizen – heeft laten zien dat een substantiële fractie van promotorgemethyleerde borsttumoren inderdaad hypergevoelig is voor PARP-remmers. We denken dus dat ook patiënten met sporadische borstkanker gekenmerkt door BRCA1-promotormethylering – of andere afwijkingen die een BRCA1-fenotype (BRCAness) induceren – zeker in aanmerking komen voor de voorgestelde behandeling met cisplatine en olaparib.”
BRCA-mutaties bij ovariumkanker
Prof. dr. Nicoline Hoogerbrugge, hoogleraar Erfelijke kanker in het Radboudumc te Nijmegen, stelt dat de komst van PARP-remmers ook het landschap van BRCA-tests bij ovariumkanker behoorlijk heeft veranderd. “Zal bij borstkankers ongeveer 5% zijn veroorzaakt door een erfelijke BRCA1-/-2-mutatie, bij ovariumkankers is dat 18%. De kans op het ontwikkelen van mammacarcinoom en/of (de sereuze vorm van) ovariumcarcinoom is in geval van BRCA1-/-2-kiembaanmutaties hoog, daarom kiest meer dan 90% van de gezonde Nederlandse BRCA-mutatiedragers voor preventieve eierstok- en eileiderverwijdering.
Tot nu toe lieten patiënten zich vrijwel uitsluitend op kiembaanmutaties testen ten behoeve van verwanten, maar dat is wezenlijk veranderd sinds zo’n test voor henzelf ook een gevolg voor de behandeling kan hebben. De in 2015 gepresenteerde nieuwe richtlijn Erfelijk ovariumcarcinoom stelt dat iedere nieuwe ovariumcarcinoompatiënt eigenlijk een indicatie heeft voor verwijzing naar een klinisch geneticus en een BRCA-kiembaantest in bloed. Binnen de genetica zijn verwijzingen voor een dergelijke test al geïndiceerd bij een kans van 10%, dus ovariumkanker zit daar ruim boven. De patiënt wordt gecounseld en krijgt na informed consent een BRCA-kiembaantest in bloed aangeboden, die overigens vrijwel altijd wordt geaccepteerd. Men denkt gezamenlijk na over wat een positieve testuitslag zou betekenen voor de familie, hoe dat zou moeten worden gecommuniceerd en of bij de patiënt zelf het risico op borstkanker is verhoogd.”
Ovarium-BRCA-tumortest
Het is volgens Hoogerbrugge een traject dat efficiënter kan, want: “Tegenwoordig komt daar dan bij dat ook als er géén kiembaanmutaties zijn gevonden, de medisch oncoloog vanwege de behandeling goede reden kan hebben om te laten testen op die 7% kans op een somatische mutatie. Een kostbare analyse, dus je vraagt je af of je dubbel werk kunt voorkomen. Daarom hebben we in Nijmegen besloten de gang van zaken om te draaien: ten behoeve van de behandeling bij iedere nieuwe patiënt met ovariumcarcinoom eerst een BRCA-tumortest en alleen in geval van positiviteit – dus in 25% van de gevallen – de patiënten via de klinisch geneticus een BRCA-kiembaantest in bloed aan te bieden: ovarium-BRCA-tumoronderzoek via de patholoog, ofwel het OPA-traject. De patholoog geeft de uitslag van de BRCA-tumortest door aan de gynaecoloog en medisch oncoloog, die deze bespreken met de patiënten. In geval van positiviteit worden de laatsten via de klinisch geneticus ingelicht over een BRCA-kiembaantest in bloed. De klinisch geneticus heeft dus alleen nog te maken met patiënten met een grote kans op BRCA-kiembaanmutaties en dat is toch een ander soort gesprek.”
Instructiefilmpje
Na validering van de BRCA-tumortest in ovariumtumorweefsel is het OPA-traject van start gegaan in Zuidoost-Nederland. Hoogerbrugge: “We evalueren ook wat de patiënt zelf van deze gang van zaken vindt en hoe dit de interacties binnen het multidisciplinaire team verandert. Belangrijk is dat binnen het team iedereen dezelfde boodschap uitstraalt, anders worden patiënten onzeker en ongerust. Ga maar na: het is nu zelfs voor veel behandelaars soms nog onduidelijk wat het verschil is tussen de consequenties van een BRCA-tumortest en een erfelijke BRCA-kiembaantest in bloed. Daarom hebben we voor zowel patiënten als gynaecologen en medisch oncologen folders en een website gemaakt, alsook een twee minuten durend instructiefilmpje voor patiënten: ‘Test op eierstokkankerweefsel’.7 Dit laat men dan aan patiënten zien, bijvoorbeeld voordat deze in gesprek gaan met de klinisch geneticus.” Uiteindelijk hoopt Hoogerbrugge het OPA-traject in heel Nederland te kunnen uitrollen.
BRCA1-/-2-mutatieanalyse
Dr. Marjolijn Ligtenberg, hoofd laboratorium Tumorgenetica van het Radboudumc, legt vervolgens uit hoe de relatief grote BRCA1-/-2-genen kunnen worden onderzocht op relevante mutaties. “We zijn in de moleculaire pathologie veelal gewend om heel gericht hotspotmutaties en amplificaties te analyseren, maar BRCA1-/-2-analyse is een andere tak van sport. BRCA1 heeft een open leesframe van 5.500 basen, BRCA2 van ruim 10.000 basen en beide zijn goed bedeeld met lastig te sequencen GC-rijke gebieden. Tumorsuppressorgenen worden pas relevant indien ze inactief zijn. En potentieel klinisch relevante inactiverende mutaties kunnen op vrijwel iedere positie zitten, dus je moet iedere nucleotide betrouwbaar kunnen sequencen. Dat vraagt nogal wat van je techniek.”
Het antwoord op deze uitdaging werd gevonden in next generation sequencing in combinatie met multiplex ligation-dependent probe amplification. “Hiermee zijn we op zoek gegaan naar exondeleties, zoals die voorkomen in de Nederlandse ovariumkankerpopulatie. Voor het bepalen van de nucleotiden in BRCA1-/-2-exonen hebben we gekozen voor een relatief nieuwe techniek, gebaseerd op single molecular inversion probes (zie Kader).” Het voordeel is aldus Ligtenberg dat het de ‘ruis’ van de analyse sterk kan verminderen.
“We kunnen nu beter oppikken of iets een bonafide mutatie is of een artefact – bijvoorbeeld ten gevolge van de formalinefixatie van het weefsel. Daarnaast kunnen we er veel lagere percentages mutant-allel mee detecteren. Bovendien maakt deze methode het mogelijk om heel nauwkeurig de gevoeligheid van de test te berekenen, dus aan welke eis de resultaten moeten voldoen om te kunnen zeggen dat de aanwezigheid van een BRCA1-/-2-mutatie onwaarschijnlijk is. Indien geen mutatie wordt gevonden, kunnen we bij een standaardanalyse met meer dan 95% zekerheid zeggen dat er geen mutatie aanwezig is in een monster met 40% tumorcellen.”
Promotorhypermethylering
Ligtenberg heeft de test inmiddels uitvoerig gevalideerd. “We vinden er alle kiembaanmutaties mee terug en dat vrijwel zonder achtergrondsignaal. Ook testen we daarbij op promotorhypermethylering. Bij een analyse van 57 weefselmonsters van 50 patiënten vonden we dat bij vijf sprake was van een somatische mutatie en bij acht van hypermethylering.” Dat laatste is op dit moment geen indicatie voor het starten van therapie, maar Ligtenberg hoopt dat deze patiënten binnenkort opgenomen kunnen worden in klinische studies.
“De mogelijkheid van het betrouwbaar detecteren van somatische mutaties geeft deze methode een meerwaarde boven een bloedtest op kiembaanmutaties. De test wordt nu standaard aangevraagd bij alle nieuw-gediagnosticeerde ovariumkankers en de testuitslag is dan binnen 2-3 weken bekend. De kans dat we een mutatie missen, is veel kleiner dan 5% – de kans dat een patiënt niet naar een klinisch geneticus gaat om een kiembaanmutatie te laten opsporen is aanzienlijk hoger.” Overigens wordt met deze analyse niet vastgesteld of er sprake is van een somatische mutatie dan wel van een kiembaanmutatie. “Voor dat laatste blijft dus een bloedtest met informed consent na een klinisch-genetische counseling vereist.”
BRCAness indirect vastgesteld
BRCAness is een fenotype dat samenhangt met fouten in BRCA1- en –2-genen, methylering van de BRCA1-promotor, maar ook met onbekende (‘sporadische’) oorzaken. Dr. Petra Nederlof, hoofd afdeling Moleculaire Diagnostiek Pathologie van het Antoni van Leeuwenhoek (AvL), presenteerde een methode om BRCAness te bepalen op basis van comparatieve genomische hybridisatie (CGH).
“De test is geïnspireerd op de wijze waarop we bij colorectale tumoren defecte mismatch repair detecteren. We kijken dan naar een ophoping van genetische fouten gemaakt door de DNA-polymerases – niet alleen gewone mutaties, maar met name repeats, aangeduid als microsatellietinstabiliteit (MSI). MSI blijkt een prima indicatie voor mismatch-repairdeficiëntie. Bij defecten in BRCA1 en –2 verwacht je daarentegen ophoping van ‘grotere’ DNA-afwijkingen, zoals translocaties, deleties, duplicaties en chromosoominstabiliteit.”
Vroeger waren dat soort chromosomale analyses erg omslachtig. Begin jaren negentig werd CGH ontwikkeld: DNA geïsoleerd uit een tumor laten hybridiseren met chromosomen uit gezonde cellen. Nederlof. “Was er sprake van een deletie, dan werd het rood, bij duplicatie groen. Genoomwijd worden zo allerlei afwijkingen zichtbaar. Vervolgens kwam de array-CGH (aCGH): specifieker, gevoeliger, sneller en grootschaliger.
Mathematische classifier
Borsttumoren met een kiembaanmutatie in BRCA1 laten genoomwijd veel meer afwijkingen zien dan sporadische borsttumoren. Nederlof: “We zien meer chromosomale afwijkingen en breuken. Door aCGH-profielen van sporadische en BRCA1-tumoren te vergelijken konden we een mathematische classifier maken waarmee patiënten kunnen worden geïdentificeerd met een grote kans op kiembaanmutaties in BRCA1. De software beoordeelt of er sprake is van toename of verlies, zoekt naar ‘sporen’, en geeft een BRCA1-waarschijnlijkheidsscore. Overigens levert methylering van de BRCA1-promotor eenzelfde profiel op, dus daarin kan de classifier geen onderscheid maken.”
De classifier werd losgelaten op diverse series, zoals tripelnegatieve borstkankers, waarin het percentage BRCA1-mutaties relatief hoog is. “Bijna 70% had een BRCA1-achtig aCGH-profiel en de klinisch-pathologische kenmerken van BRCA1-gemuteerde tumoren. Afhankelijk van de onderzochte patiëntenserie had 3-14% een BRCA1-mutatie en bij 24-36% was sprake van BRCA1-promotormethylering, die overigens nimmer samenging met een BRCA1-kiembaanmutatie.”8 Inmiddels is er ook een classifier ontwikkeld voor BRCA2-ness.
Uit onderzoek van dr. Marieke Vollebergh blijkt dat de aCGH-classifier ook de respons op chemotherapie kan voorspellen: tripelnegatieve (maar ook ER-positieve) tumoren met aCGH-BRCA1-ness bleken veel gevoeliger voor de combinatie cyclofosfamide, thiotepa en carboplatine dan tumoren zonder BRCA1-kenmerken.9,10 Nederlof: “Momenteel onderzoeken we in hoeverre de classifier de effectiviteit van PARP-remmers voorspelt.”
Nederlof concludeerde dat de aCGH-classifier een duidelijke meerwaarde heeft boven somatische mutatieanalyse. “Deze pikt blijkbaar alle genetische veranderingen op die tot dezelfde BRCA-achtige kenmerken leiden. We hebben nu in het AvL een aantal klinische studies lopen waarin de aCGH-BRCAness wordt gebruikt in de inclusiecriteria.” Op een vraag uit het publiek of er ook BRCA1-gemuteerde tumoren worden gevonden zonder BRCAness: “Een klein percentage BRCA1-tumoren is ER-positief en opmerkelijk is dat die nu juist meer een BRCA2-achtig karakter vertonen.”
Functionele BRCAness-test
Medisch bioloog dr. Maaike Vreeswijk, werkzaam op de afdeling Humane Genetica van het LUMC, ging tot slot in op de ontwikkeling van een functionele test om BRCAness in borst- en ovariumtumoren te kunnen identificeren. Behalve BRCA1-/-2– zijn er nog talloze andere genen betrokken bij HR. “20% van de ovariumtumoren dankt HR-deficiëntie aan BRCA-mutaties, 10% aan BRCA1-promotormethylering en 10,5% vertoont veranderingen in andere genen die mogelijkerwijs tot HR-deficiëntie kunnen leiden en dus tot gevoeligheid voor PARP-remmers.11 Dat verruimt de potentiële patiëntenpopulatie voor de behandeling met deze remmers aanzienlijk, maar dat betekent nog niet dat DNA-sequencing hier de oplossing is. DNA-schadeherstel is een duizelingwekkend complex netwerk van onderling afhankelijke processen en het is dus zeer de vraag of het tumorgenotype enige functionaliteit voorspelt.”
Personalized medicine is aldus Vreeswijk zeker niet hetzelfde als genomics. “Het fenotype HR-defect hoeft niet te zijn veroorzaakt door een verandering in één gen. Ook zou het kunnen dat een mutatie in een heel ander gen de HR weer herstelt. Het is dus zinvol om onafhankelijk van onderliggende mechanismen te checken in hoeverre HR inderdaad niet meer functioneert, om echt te kijken naar een snapshot van de tumor.”
RAD51-eiwitten
Hoe werkt zo’n functionele analyse in de praktijk? Vreeswijk: “Tumorweefselplakjes of afgedraaide cellen uit ascites of pleuraal effusievocht worden direct na afname bij de patiënt onderworpen aan straling die dubbelstrengs-DNA-breuken induceert. Na een incubatie van enkele uren wordt het materiaal gefixeerd en ingebed in paraffine. Vervolgens voeren we een immunohistochemische kleuring uit gericht tegen het RAD51-eiwit dat zich tijdens HR bindt aan dubbelstrengs-DNA-breuken. Die eiwitten hebben zich geclusterd tot foci en zijn zichtbaar als stippen in de kern van de tumorcel. Bij het ontbreken van RAD51-foci is in principe sprake van HR-deficiëntie. Als extra check voeren we op dezelfde coupes immuunhistochemische kleuringen uit voor het eiwit geminine: hiermee markeren we de cellen in de S-/G2-fase van de celcyclus, de fase waarin DNA-reparatie plaatsvindt.”
In het kader van een samen met het Erasmus MC uitgevoerd EU-project is deze DNA-schaderesponstest uitgevoerd op borst- en ovariumtumoren. In een eerste serie van 45 primaire borsttumoren bleken er vijf geen RAD51-stralingsfoci te vertonen. Genetische analyse van deze samples liet zien dat in drie gevallen sprake was BRCA2-mutaties en in twee van BRCA1-promotormethylering.12 Uit deze eerste serie bleek dus dat de test inderdaad in staat is om BRCA-gerelateerde tumoren te identificeren.
In Leiden wordt het kwantificeren van RAD51-foci nu toegepast op zowel borst- als ovariumtumoren, maar het is volgens Vreeswijk in principe toepasbaar op willekeurig welk tumortype. “We proberen nu te achterhalen of bij HR-deficiëntie altijd sprake is van een BRCA-defect en in hoeverre BRCA-gemuteerde tumoren altijd HR-deficiënt zijn.” In een volgende stap wordt samen met het Erasmus MC, UMC Groningen en het Nederlands Kanker Instituut en met ondersteuning van het Alpe d’HuZes/KWF-fonds een klinische studie opgezet waarbij het resultaat van de RAD51-analyse wordt gecorreleerd aan gevoeligheid voor platinumbevattende medicijnen en PARP-remmers.
Referenties
1. Bryant HE, et al. Nature 2005;434:913-7.
2. Farmer H, et al. Nature 2005;434:917-21.
3. Tutt A, et al. Lancet 2010;376:235-44.
4. Liu X, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:12111-6.
5. Rottenberg S, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:17079-84.
6. Ledermann J, et al. Lancet Oncol 2014;15:852-61.
7. ‘Test op eierstokkankerweefsel’. Te raadplegen via www.radboudumc.nl/erfelijkeborstkanker
8. Lips EH, et al. Br J Cancer 2013;108:2172-7.
9. Vollebergh MA, et al. Annals Oncol 2011;22:1561-70.
10. Vollebergh MA, et al. Breast Cancer Res 2014;16:R47.
11. Konstantinopoulos PA, et al. Cancer Discov 2015;5:1137-54.
12. Naipal KA, et al. Clin Cancer Res 2014;20:4816-26.
Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapjournalist
Oncologie Up-to-date 2016 vol 7 nummer 2
[kadertekst]
Multiplex ligation-dependent single molecular inversion probe amplification Het principe is eenvoudig: gebruik als DNA-probe een oligonucleotide waarvan alleen de uiteinden hybridiseren met sequenties die het te analyseren BRCA-exon begrenzen, maar wel zodanig dat die bindende delen 180o ten opzichte van elkaar zijn gedraaid en het niet-hybridiserende tussengedeelte een losse lus vormt. Dat maakt het mogelijk om met behulp van DNA-polymerase en -ligase het hele gebied tussen de hybridisatieplaatsen op te vullen met complementaire nucleotiden en aldus de lus te sluiten. Zo ontstaat er een circulair enkelstrengs-DNA dat naast de oorspronkelijke probe ook de genetische code van het exon bevat. Die laatste kan vervolgens gemakkelijk worden vrijgemaakt, verrijkt, geamplificeerd en gesequencet.
DEEL DIT ARTIKEL:
